taqman法进行实时定量pcr鉴定

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1、3.3TaqMan法进行实时定量PCR鉴定较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条件。PCR反应在AppliedBiosystemsStcpOncTMReal-TimePCRSystem(ABI公司仪器)sequencedetector中进行。采TaqMan法进行绝对定量p()HeLa细胞中mtDNA的拷贝数。3.3.1荧光定量试剂及探针(1)PremixExTaq™(PerfectRealTime),购自宝生物工程(大连)有限公司。(2)PCR反应引物以及探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。3

2、.3.2构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中的(}-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因K(>1，其中0-actin基因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为木实验室扩增线粒体全序列的引物中的第九对引物［41］。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以及复性温度见表6。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温度依据表6。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。引物名称引物位置引物序列(5’一>3’)目的片段长度复性

3、温度p-actinF1997-2017ACCCACACTGTGCCCATCTAC107bp58°C(i-actinR2103-2081TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTACox-IFl5835-5855GAGGCCTAACCCCTGTCTTT827bp59°CCox-IR16661-6642ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT表6F表示正向引物，R表示反向引物。F与R用于扩增基因的一段区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-nF与Cox-fR1用于扩增Cox-/基因的一段序列。3.3.3感受态的制备(于超

4、净工作台无菌条件下及冰上操作)(1)取上述1ml培养液于1.5mlEP管。(2)4°C4000rpm离心5min,弃上清。(3)加入100pi冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动使沉淀悬浮(可轻轻吹打)。(4)4°C4000rpm离心5min,弃上清。(5)加入100pi冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动使沉淀悬浮。(6)感受态细胞制作完成(可直接用于DNA转化实验或-80°C保存，以备后用)。3.3.4目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，总量为5pi。pMD™18-TVect

5、or1(ilInsertDNA0.1pmol〜0.3pmoldH2O补至5pi(1)加入5pi(等量)的SolutionIo(2)16°C连接过夜(8小时)提高反应效率及连接产率。(3)取-80°C保存感受态细胞冰中融化10min。(4)取100pi的感受态细胞移至新的EP管中。(5)向感受态细胞中加入(3-10pi)的转化用DNA(连接产物)，轻轻混匀后冰中放置30min。(6)42°C水浴中放置45s-60s后，立即于冰中放置1-2min。(7)加入890pi37°C预温的SOC培养基。(8)37°C振荡培养1h(<200rp

6、m)o(9)取适量于含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，将平板倒置于37°C培养箱中培养过夜形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。(10)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。确认培养菌落，进行下步实验。(11)取3mlLB各支加3

7、il氨苄，挑取菌落于其中，37°C(150-200rpm)轻振荡过夜。3.3.5使用质粒提取试剂盒提取质粒测序以及质粒浓度的测定时对质粒DNA的纯度要求较高，本试验采用宝生物公司的质粒提取试剂盒MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.

8、0进行质粒的提取。该试剂盒是用于质粒(Plasmid)DNA小量纯化的试剂盒，采用了传统的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需1小时便可完成。使用本试剂盒可从1〜4ml的过夜培养的菌液中纯化得到1〜20pg的高纯度质粒DNA(OD260/OD280=1.8〜2.0),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。(一)试剂盒组成RNaseA1(50mg/ml)32(JSolutionI15mlSolutionII15mlSolutionIII24mlRinseA28mlRinse

9、B80mlElutionBuffer4ml(二)按照MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0说明做如下操作：(1)取菌液1.5ml于1.5ml的离心管中，12000rpm离心2min弃上清。(2)用250pi的So