pet系统表达常见问题

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1、pET系统足H前应用敁为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆歯中表达广各种各样的异源蛋白。经过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常址W题。在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。1.B的蛋G总足以不可溶的形式出现真是令人烦恼在人肠杆菌屮表达的异源蛋A经常发生错误的折抒，弁聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛍白通常可达细胞总蛋白的50%以上。也然冇一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%

2、(甚至更多)的蛋白则在包涵体屮。实践中，有很多实验室采収降低诱导溫度，例如25-30°C(Burtonetal.(1991)Prot.Exp.Purif.2,432-441),或降低1PTG浓度(0.01-0.1mM)并延长诱导吋间，还奋采川特别的培养基(BlackwellandHorgan(1991)FEBSLett.295，10-12)等方法获得更多的可溶蛋0。随着越來越多的蛋D折佥途径被阐明，相倌会出现更多有效的增加可溶性鬥的蛋白的实验方法。然而，让鬥的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。不溶态在某些情况下

3、非常有利：a.形成包涵体足n的缶白表达量很商的表现。b.作为初步分离，将H的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75-95%的FI的蛋白。c.存4:于包涵体中的鬥的蛋白通常4以免于蛋白酶的水解破坏作用。纯化的包涵体可以用多种方法重新溶解，以便进一步进行纯化和重折矜操作。如果目的蛋白是用于制备抗原，经PBS悬浮和适当的佐剂乳化处理后，就可以直接用于注射了(参见Fischeretal1992)Science257,1392-1395)o如果目的蛋白融合了His-Tag(r)序列

4、，贝1J可以在变性条件下川His?Bind(r)树脂亲和纯化。经纯化的蛋內川变性条件从树脂洗脱，冉行重折叠。溶解和重折叠常常要川到离液剂、助溶剂和去污剂等(MarstonandHartley1990)Meth.Enzymol.182,264-276)o研究者采用卜述方法加强蛋ft熏折荇的效果，并在很多蛋白上取得了好结果，可以尝试以下：当蛋白还结合在树脂上时，使用6M-0M梯度盐酸胍、ImM还原型及0.2mM氧化型谷胱U•肽处理，继而用咪唑正常洗脱。有些实验室在透析去除变性剂的过程中加入底物或类似物，也有帮助酶折叠

5、的效果(Zhietal.(1992)Prot.Scil,522-529;Tayloretal.(1992)Prot.Engin5,455-459)o2.是否所冇的位点特异性蛋白酶都冇一样的酶切特性，而仅仅只是识别位点冇所不同呢？位点特异性蛋D酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被川來切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾叫性很不扣M。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为l:20(X)的蛋白。Xa因了似乎对于切点周喇的序列很敏盛，经常会出现特异性位点切割不珂想却发生别的位点被切割的情况。肠激

6、酶的专一性足上述三种屮最好的，俏由于切割效率低(通常要求质跫比达到1:10)而.W得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采川生物素化凝血酶(货号69672)结合链亲和索琼脂糖(货号69203)-起使用。尽管没冇一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型1.必须去除融介多肽成蛋门才能使目的蛋门获得活性叫?人多数情况卜'0的缶白带奋His?Tag,S?Tag?,11个氨基酸的T7?Tag?或HS

7、V?Tag?等小肽时仍能表现出完全的活性。这些肽段相对都较为亲水，而理论上这样不会干扰蛋白的三维结构。我们建议首先测试蛋白活性，再看足否一定要去除前导序列才能适介特定的应用要求。2.如果目的蛋白包含倌号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形忒存在？抑或目的蛋白K•至可以被分泌到生长培养葙中？N-端如果带柯ompT或pelB这样的前导序列是使目的蛋白进入细胞周质的必要非充分条什。如果在生K培养蕪中发现R的蛋白的话，多半足因为细胞壁收到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养®里的（StaderandSiIhavy（

8、1990）Meth.Enzymol.l85，166-187）。穿过大肠杆菌内膜的机制还不甚了了（综述见Wickneretal.（1991）Ann.Rev.Biochem.60,101-124）O己经淸您了蛋白的成熟区对转运也有影响。虽然根据紧跟/十:信号肽序列后的n的蛋白序列可以对其输岀的讨能作个人概判断；但是由于蛋白的输出效率依赖于目的®白的特性，还是不能仅仅根据k序列