bca法测蛋白浓度（课件）

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1、实验二BCA法测定蛋白质浓度(BCAproteinconcentrationdetermination)耿磊生物化学教研室（301室）邮箱：sypgl@126.com1内容注意事项前言实验目的实验原理思考实验步骤2前言前言一、蛋白质的理化性质？（一）、蛋白质的胶体性质（二）、蛋白质的两性电离和等电点（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚（四）、蛋白质的紫外吸收（五）、蛋白质的呈色反应3（一）、蛋白质的胶体性质前言蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面

2、电荷、水化膜4（二）、蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。前言5（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理

3、化性质改变和生物活性的丧失。*蛋白质沉淀（precipitation）在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。前言6由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。前言（四）、蛋白质的紫外吸收7（五）、蛋白质的呈色反应

4、前言蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)⒉双缩脲反应(biuretreaction)3.Folin-酚试剂反应8前言二、蛋白质的测定方法？（一）紫外线吸收法（二）双缩脲法（三）Folin-酚试剂法（四)考马斯亮蓝结合法（五）改良微量凯式定氮法（六）BCA法9前言(一）紫外吸收法由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，

5、蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。缺点：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干扰测定。10前言（二）双缩脲法H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2→H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3双缩脲双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。优点：操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。缺点：灵敏度较差，本法测定蛋白质范围1-20mg；特异性不高11前言蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反

6、应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍。缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。（三）Folin-酚试剂法12考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓度成

7、正比，故可用于蛋白质定量测定。优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比色杯染色严重，影响重复性。前言（四)考马斯亮蓝结合法13蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相当恒定，一般为16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含量。优点：准确度高，可测定不同形态样品。缺点：灵敏度低，适用于0.2～1.0mg氮，误差为±2％费时。前言（五）改良微量凯式定氮法14（六）

8、BCA法碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。优点：操作简便、快速、灵敏度高，准