bca法测肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌sr膜蛋白浓度

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1、BCA法测肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌SR膜蛋白浓度叶兆伟，李洵，王海燕，李尽哲，承伟【摘要】目的测定肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌膜蛋白浓度。方法蔗糖梯度离心法对肺动脉平滑肌膜蛋白进行提取;二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法测定膜蛋白浓度;G-6-Pase定量试剂盒测定平滑肌肌浆网(SR)标志酶G-6-Pase活性。结果经测定MCT组和对照组G-6-Pase活性分别为(19.5±2.41)IU/g和(18.35±2.21)IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆G-6-Pase活性(1.23±0.14)IU/g和(1.15±0.17)IU/g;测定波长为

2、595nm，在0.025～0.5mg/ml时，线性关系良好，r=0.9976。结论提取的SR有较高纯度;BCA法可以用于平滑肌SR膜蛋白浓度的测定。【关键词】野百合碱;肺动脉高压;SR;BCA法　目前测定蛋白浓度有很多种方法，其中二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lo处有高的光吸收值并与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与Loa公司);抑肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)(AmrescoSolarbio公司);BCA蛋白测量试剂盒(北京天来生物医药科技有限公司);葡萄糖-6-磷酸酶定量

3、试剂盒(广州天河天一医药保健品公司);其它试剂均为国产分析纯。　　1.3仪器ULTRA.Pro80型高速低温离心机(美国SORVALL公司);7170A型全自动生化分析仪(日本日立公司);ELX-800型酶标仪(美国宝特公司)。　　2方法　　2.1溶液的制备[1]　　2.1.1匀浆液30mmol·L-1Tris-马来酸(Tris-maleate)，3.0mol·L-1蔗糖，3mmol·L-1MgCl2，2mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)，1μmol·L-1胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)，1μmol·L-1亮肽素(leupeptin)，2.4U抑肽酶(aproti

4、nin)，0.1mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)，1μmol·L-1抗坏血酸钠(Nasocorbate)，pH7.2。　　2.1.2萃取液30mmol·L-1Tris-maleate，0.3mol·L-1蔗糖，0.6mol·L-1KCl，1μmol·L-1leupeptin，0.1mmol·L-1PMFS，pH7.2。　　2.1.3储存液30mmol·L-1Tris-maleate，0.3mol·L-1蔗糖，1μmol·L-1leupeptin，0.1mmol·L-1PMSF，pH7.2。　　2.1.4BCA“工作液”按50体积BCA试剂A溶液加1体积BCA试剂B

5、溶液配制，充分混匀备用。　　2.2大鼠肺动脉高压的建立[2]健康成年CT生理盐水溶液(60mg·kg-1)，饲养21d后取出肺和心脏。剪下右心室，左心室、分离室间隔，称重，计算右心室/(左心室+室间隔重量)[RV/(LV+S)]之值。　　2.3SR的提取及纯度鉴定　　2.3.1SR的提取参照文献[3]采用差速离心法制取肺动脉SR。正常与PAH大鼠各10只，雄雌不限，体质量250～300g。无菌生理盐水配成20%乌拉坦溶液，按0.5ml/100g体重的剂量进行腹腔麻醉，麻醉后快速开胸取出心肺组织，分离肺动脉上的结缔组织，尽可能向肺内部延伸，剪断取出，立即置于-80℃保存。　

6、　取冻存的MCT组和对照组肺动脉，称重为0.6695g和0.2527g。按照重量∶体积(V/m3)，匀浆，完毕后收集匀浆液于冷冻离心试管中，低速离心(3800×g，20min)，所得上清液用于制备SR。　　取上清液高速离心(4℃，12000×g，20min)，离心毕收集上清液于-80℃保存。　　将离心后保存的上清液解冻，倒入低温高速离心试管中，冷冻高速离心机离心30min(4℃，143000×g)。倾去上清液，保留沉淀，分别加入6ml萃取液，充分振荡，使其混匀。配平，在原来转速、温度不变的情况下，离心45min。离心毕，倾去上清液，保留沉淀，称重记录。　　离心管中加入储存

7、液各5ml，振荡混合均匀，转移至提前准备好的青霉素小瓶中，分装后以超低温冰箱速冻，-80℃保存。　　2.3.2SR的纯度鉴定[4]利用7170A型全自动生化分析仪和G-6-Pase定量试剂盒，对经蔗糖差速离心法提取的对照组和MCT组SR标本中SR标志酶G-6-Pase活性进行检测。　　2.4BCA法测蛋白浓度取试剂盒中蛋白标准品-牛血清蛋白10μl，用0.9%生理盐水90μl稀释，使终浓度为0.5mg/ml，此即为标准品稀释液。　　取标准品稀释液按1，2，4，8，12，16，20μl加入到96孔平板的标准品孔中，加0.9%Na