低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡

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1、低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡作者：刘婷李运成钱桂生张志远杨昱王关嵩【摘要】目的研究bcl2、bax凋亡相关基因在低氧处理大鼠肺动脉中的表达，探讨低氧肺动脉高压的发病机制及防治措施。方法36只C)的增殖可能是导致PH形成的重要环节，增加平滑肌细胞凋亡可以逆转PH肺血管重建〔2〕。在bcl2基因家族中，bcl2是凋亡抑制基因，bax是凋亡诱导基因，二者比率是影响细胞凋亡的关键。以往体外研究〔2〕发现，低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，而低浓度CO可以部分抑制低氧对肺动脉平滑肌细胞的作用。为深入探讨其机制，本研究利用全自动缺氧舱复制低氧性PH大鼠模型，分别给予常氧、低氧、低氧与低浓度C

2、O处理，观察肺动脉bcl2、bax基因的变化，探讨PH发病机制，为其防治提供新的思路。　　1材料与方法　　1.1低氧PH大鼠模型制备及处理分组　　选择健康成年雄性erck产品)消化，37℃孵育5min；0.1mol/L甘氨酸/0.1mol/LPBS漂洗5min；4%多聚甲醛漂洗5min；0.1mol/LPBS漂洗5min×3，再2×SSC漂洗10min；预杂交后置42℃水浴中2h；在每张片子上加20μl地高辛标记探针杂交液，用DEPC水处理的膜覆盖，于湿盒中42℃孵育20h；取出切片，去膜，4×SSC及PBS充分漂洗；滴加AntiDigAp抗体；NBT/BCIP室温避光显色4～6h；0.

3、05mol/LPBS充分漂洗，终止显色反应；中性树胶封片。原位杂交染色结果的判定，以细胞浆和胞膜内出现明确的紫蓝色细颗粒为阳性染色。无阳性信号(-)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞26%～50%；强阳性()，阳性细胞51%～75%；强阳性()，阳性细胞>75%。　　1.4免疫组织化学　　所用的抗体bcl2为兔抗人单克隆抗体，购自加美国SantaCruz公司，工作浓度1∶50；bax为兔抗人多克隆抗体，购自加美国SantaCruz公司，工作浓度1∶30；生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1∶200。具体方法参见〔4〕。结果判定：背

4、景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性信号(-)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞25%～50%；强阳性()，阳性细胞50%～75%；强阳性()，阳性细胞>75%。　　1.5统计学分析　　实验结果应用SPSS12.0统计软件进行统计学分析，组间率的比较用χ2检验。　　2结果　　2.1原位凋亡结果　　荧光显微镜下可见低浓度CO组肺动脉组织有明显的凋亡标记，而常氧组仅见很弱的荧光。正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度CO组的阳性率分别为8.1%，37.6%，76.5%三者差异显著(P<0.01)，见图1。　　2.2原位杂交检测结果　　bax、bcl2

5、mRNA阳性细胞细胞浆和细胞膜着紫蓝色颗粒，均匀着色，阳性细胞呈不均匀分布。正常对照组bax、bcl2杂交呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)。低氧PH组bax杂交呈中等强度的紫蓝色，为弱阳性表达()，低浓度CO组呈极强的紫蓝色，为强阳性表达()；但bcl2杂交,可见低氧PH组细胞胞浆呈强的紫蓝色，为强阳性表达()，低浓度CO组呈微弱的紫蓝色，为弱阳性表达(+)，见图2。　　2.3免疫组织化学染色的情况　　结果表明，正常对照组免疫组织化学染色bcl2、bax均很弱；低浓度CO组bcl2、bax均有升高，以bax为著(78.9%)，与低氧PH组比较有显著差异(P＜0.01)；低氧PH

6、组bax虽然也有表达，但程度较弱，且bcl2表达处于优势(80.0%)，与低浓度CO组比较有显著差异(P＜0.01)。肺动脉凋亡主要发生在内皮细胞和平滑肌细胞，见图2、表1、表2。表1各组大鼠肺动脉bcl2凋亡的蛋白质表达情况，表2各组大鼠肺动脉bax凋亡的蛋白质表达情况（略）。　　3讨论　　近年来，随着细胞凋亡在肺动脉高压研究中的不断深入，人们已经注意到肺动脉高压时，肺组织细胞可以细胞凋亡方式出现，并在发病中起到一定作用。bcl2被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一，其属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上。bcl2和bax同属于bcl2家族，但二者功能相反，bcl2抑

7、制凋亡的促进增殖，而bax促进细胞凋亡〔5〕。一般认为bcl2通过控制细胞核内外物质的运输和抑制Ca2+的释放或阻断细胞内过氧化物的堆积而发挥抗凋亡作用。而bax作为bcl2的同源体，其作用是抑制bcl2作用，其与bcl2基因一样在组织广泛表达。bax与bcl2在细胞中的比例决定细胞是否发生凋亡，bax过量时，形成baxbax同二聚体，诱导细胞凋亡；bcl2过量时，形成bcl2异二