BCA蛋白浓度测定-酶标仪法.doc

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1、BCA法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1.BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：a)BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存b)BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存c)蛋白标准（5mg/mlBSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存二、仪器和试剂1.酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅2.96孔单条可拆酶标板（平底）3.15ml离心管1个（准备BCA工作液用）4.1.5ml离心管1个（准备蛋白

2、标准品工作液用）5.单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头6.PBS三、操作步骤1.水浴锅调至37℃。2.蛋白标准品工作液（1mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取出，完全溶解并混匀。取60μl蛋白标准品（5mg/ml），加入240μlPBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1mg/ml）。3.计算BCA工作液总量=0.2ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BC

3、A工作液室温24小时内稳定。样本数(n)1~56~78~1011~1213~1415~1617~1920~2122~2324~26A（ml）6789101112131415B（ml）0.120.140.160.180.20.220.240.260.280.3总量(ml)6.127.148.169.1810.211.2212.2413.2614.2815.34.按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。单条酶标板蛋白标准品工作液（1mg/ml）(ml)PBS(ml)蛋白标准品终浓度(mg/ml)AS001

4、000BS15950.05CS210900.1DS320800.2ES430700.3FS540600.4GS650500.5HS710001.021.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。（1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）（2）再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔

5、（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。123456789101112AS0S0N1N1BS1S1N2N2CS2S2N3N3DS3S3N4N4ES4S4N5N5FS5S5N6N6GS6S6N7N7HS7S7N8N82.用排枪在各孔中加入200μlBCA工作液，轻轻摇匀，37℃放置30分钟或室温放置2小时。（注意：①每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。②如果浓度较低，可适

6、当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）3.用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。4.用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算公式Y=A´X+B。根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。5.按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml，分装为每支100μl。2