BCA法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度.pdf

《BCA法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、精品文档分光光度法介绍分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。一Lambert定律当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。设：入射光强度为I，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。0I0lg=KLI1K是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。1二Beer定律当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光

2、线减弱的比例与溶液浓度呈正比。I0lg=KCI2K为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。2三Lambert-Beer定律将以上两个定律合并：Iolg=KCLIIoI令A=lgT=则A=KCL=-lgTIIoT为透光度，A为吸光度，K为消光系数四待测样品浓度的计算A=KCLA=KCL标标样样由于是同一物质及相同的光程，则：A/A=KCL/KCL=C/C即：C=（A/A）*C样标样标样标样样标样故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。1。欢迎下载精品文档一实验名称：BCA法测定蛋白质含量二实验原理：BC

3、A即二奎碄甲酸。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。三实验步骤：A标准品的稀释：将9支干燥的1.5ml离心管编号，按表加入下列试剂：BCA法标准曲线和样品测定1.2ml离心蛋白质终浓度（μddHO（μL）2mg/mLBSA（μL）管2g/mL)A050μL标准品2000B125375μL标准品1500C325325μL标准品1000D175175μLB管混合液750E3253

4、25μLC管混合液500F325325μLE管混合液250G325325μLF管混合液125H400100μLG管混合液25I40000=BlankB配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。C标准品及样品的测定：1）分别取25μL上表中新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中；2）每孔中加入200μLBCA工作液，并充分混匀；3）加盖，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h；4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准

5、曲线。计算样品的蛋白浓度。四实验结果：实验数据如下：STANDARD（加粗数据是样品吸光度）AC1.8311.95120001.3371.45715001.0311.25110007500.6110.7555000.3290.4492500.1620.2821250.0490.1692500.1200.6030.7232欢迎下载。精品文档2y=0.0009x+0.0688R2=0.99121.51系列10.5线性(系列1)005001000150020002500将样品数据代入方程：得出：x=726.89μg/mL，即样品中的蛋白质浓度为726

6、.89μg/mL五讨论：1从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高。2配制溶液时一定要细心，不要配错，正确使用移液枪，及时换枪头，避免污染；3当离心管中已经注入溶液，小心不要因为过失而导致其漏液，造成损失；4测定吸光度时注意调整波长；5该方法快速，灵敏度高，试剂稳定性好，对不同种类蛋白质的检测的变异系数小，而且BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响，低浓度的去垢剂不影响检验结果，在微孔板中进行测定，可以大大节约样品和试剂用量。6此种方法的测定范围是20~2000μg/mL3欢迎下载。精品

7、文档一实验名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量：二实验原理：考马斯亮蓝在酸性条件下和蛋白质结合，使染料最大吸收值从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定范围为50μg-1000μg/ml三实验步骤：A考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和的颠倒混匀；B标准品的稀释：将7支干燥试管编号，按表加入下列试剂：考马斯亮蓝法标准曲线和样品测定试剂0123456BSA液（μl）2mg/ml05102030600PBS(μl)150145140130

8、12090150蛋白质终含量（mg/mL)00.0670.130.270.40.80C标准品及样品的测定1）将5μL体积的样品加入到试管中，并用PBS