broadford法测蛋白浓度

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1、一、原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。因此考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250（CoomassieG-250）是一种蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。但考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成的复合物是蓝色溶液，使该染料的最大吸收λmax的位置从

2、465变成了595，在595nm处有最大吸收值。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因此利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。优点：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那

3、样费时和严格地控制时间。注：测定时要在染色后5-20分钟内测定光吸收，不可太快，我之前就不小心吃了这个亏，弄得数据很不稳定。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的

4、NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。二、操作方法1.试剂（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。（颜色是褐红色，不能用R-250，R-250的颜色是蓝色的，要小心别弄错哦）2.标准曲线测定法注：样品的添加量问题要注意一

5、下，我之前看有的资料说加1ml,有的资料加0.1ml,我都给弄混了，现在终于弄明白，其实：样品的添加量取决于你要测的蛋白的浓度，要浓度稀时，加1ml的量(即加样品后，用水补充到1ml)；浓度较大或适中时，加0.1ml3.操作过程：（加至1ml的）分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准

6、曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080去离子水/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A595加至0.1ml的，基本过程同上，数据是上面的1/10：各试管的试剂添加量如下，试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯

7、亮蓝试剂（mL）5mL4.测量蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者

8、根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白