黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制的尿液代谢组学研究

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1、黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制的尿液代谢组学研究摘要采用基于液相色谱飞行时间质谱联用（LCTOFMS）技术的代谢组学方法，分析大鼠尿液内源性代谢物的变化，研究黄芪口服液（HO）降低大鼠顺铂（CDDP）毒性的作用机制。采用低剂量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型，并连续给予16天HO。于第18天收集正常对照（Control）组、顺铂模型（CDDP）组和黄芪口服液（HO）组大鼠的24h尿液，进行LCTOFMS分析，以获取尿液代谢物组数据集，对所得数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）等多元统计分析，以筛选潜在生

2、物标志物。于第20天采集大鼠血清测定肌酐和尿素氮水平。血清指标测定结果表明，HO可以显著降低CDDP染毒大鼠的肌酐和尿素氮水平（p<0.05）。PCA得分图显示，3组可分别聚类，HO组位于Control组和CDDP组中间，表明HO可部分改善CDDP所致大鼠尿液代谢产物的异常变化。综合OPLSDA分析、t检验和倍数变化分析结果，最终共筛选并初步鉴定出35个尿液代谢产物作为HO减毒相关的潜在生物标记物。代谢通路分析结果表明，HO可通过纠正体内氨基酸代谢、能量代谢和核苷酸代谢等通路的紊乱，降低CDDP所致机体毒性。中国8/vie　　关键词黄芪口服液；顺铂；尿液；代

3、谢组学；液相色谱飞行时间质谱联用；毒性　　1引言　　顺铂（Cisdiaminedichloroplatinum，CDDP）对多种实体瘤具有良好的抗肿瘤疗效，基于CDDP的化疗方案目前依然是包括进展期非小细胞肺癌在内的多种癌症临床治疗的标准一线化疗方案[1]。虽然疗效确切，但CDDP多发的严重毒副作用，特别是剂量限制性肾毒性，极大地限制了其临床应用。因此，寻找能有效降低CDDP化疗毒性，同时不降低乃至可增加其抗癌活性的化疗辅助药物逐渐成为研究热点。研究表明，CDDP导致机体毒性的过程涉及到氧化损伤、细胞凋亡、炎症反应、线粒体机能失调、NO受体、内皮缩血管肽受体

4、和肾血流量动力学变化等多条内外源通路和多个环节[2～4]。因此，理想的CDDP化疗保护剂也应该具有多环节多途径的解毒机制。　　传统中药具有多成分、多途径、多靶点协同增效的整体作用特点，因此有望在防治CDDP机体毒性方面发挥独特优势。黄芪（Radixastragali）为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmebrananceus（Fisch.）Bge.和蒙古黄芪A.mongholicus（Bge.）Hsiao.的干燥根。性温，味甘，归肺、脾经。黄芪为常用补气中药，用药历史悠久，《神农本草经》将其列为上品。目前，黄芪以单味药或复方广泛应用于临床肿瘤治疗。临床研

5、究显示，黄芪可增强肿瘤患者机�or冷冻高速离心机、AU5800生化仪（美国Beckman公司）。　　甲醇和乙腈（HPLC级，德国默克公司）；甲酸和甲酸铵（HPLC级，美国Tedia公司）；肌酐和尿素氮测定试剂（美国Beckman公司）。SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，实验动物许可证：SCXK（沪）20130006。黄芪口服液（江苏省中医院院内制剂，产品批号：1501001，10mL/支）；注射用顺铂（CDDP，冻干型）源自齐鲁制药（海南）有限公司（批号：2illiporeMilliQAdvantageA10超纯水机制备的超纯水。　　2.2动物实验及样

6、品处理　　雄性SD大鼠24只，随机均分为3组，分别为：（A）顺铂模型组（CDDPgroup）；（B）黄芪口服液组（HOgroup）；（C）正常对照组（Controlgroup）。适应1周后，A和B组均腹腔注射给予CDDP，给药时间分别为第1，3，7，11，14天，共计5次，每次剂量为2.5mg/kg；C组腹腔注射等量生理盐水。期间B组每日灌胃给予剂量为每只2mLHO，连续16天。于第18天搜集各组大鼠24h尿液，　　70℃冻存备用；于第20天采集各组大鼠血清，采用BECKMANAU5800生化仪测定血清肌酐和尿素氮水平，采用单因素方差分析对测定结果进行统计分

7、析。　　样品分析前，室温解冻各尿液样品，涡旋混匀，吸取200μL，依次加入500μL甲醇，300μL水，涡旋振荡1min混匀，在4℃以12000g离心10min，取上清液进行LCMS分析。同时取每个尿样的上清液各20μL，涡旋混匀作为质控（QC）样品。