肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究

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1、肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制研究叶惠芬刘朝晖周小棉陈惠玲赵祝香【摘要】目的研究肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药机制。方法采用浓度梯度法(Etest)测定细菌对各种抗菌药物最低抑菌浓度，聚合酶链反应(PCR)扩增β内酰胺酶基因，并对扩增产物进行基因测序，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)进行外膜蛋白(OMP)分析。用抑制试验进行主动外排机制检测。结果4株菌株全部携带有SHV12型和DHA1型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)基因，3株携带CTXM14型ESBLs基因；4株菌外膜蛋白分析发现，肺炎克雷伯菌

2、亚胺培南耐药株与敏感株相比，缺少分子量在32500～47500之间的一条带，从位置判断该条带可能为OMP36000或OMP37000的一种外膜蛋白；主动外排检测全部为阴性。结论同时产多种β内酰胺酶合并外膜蛋白缺失可能是导致本组肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药的原因。【关键词】肺炎克雷伯菌；β内酰胺酶；外膜蛋白ABSTRACTObjectiveToinvestigatethemechanismofKlebsiellapneumoniaeresistanttoimipenem.MethodsTheminimalinhibitiveco

3、ncentrations(MIC)oftheantimicrobialagentsinedbyEtest.Thegenescodedtheβlactamaseplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),andthesequencesembraneproteins(OMPs)dodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDSPAGE).ReserpineinhibitiontestoniaproducedSHV12andDHA1genoty

4、pe.Theyalsoproducedotherβlactamase(CTXM14type,3isolates).paredtoimipenemsensitiveisolatesbySDSPAGE,theimipenemresistantisolatesmarkedlylackedtheproteinbandofabout36.71kuightbetheoutermembraneproteinsofOmp36,000orOmp37,000accordingtotheelectrophoresismobility.Th

5、eactiveeffluxtestoniaeproducedmorethanoneβlactamaseandthelossofoutermembraneproteinsmaybeaccountedfortheoccurrenceofimipenemresistance.KEYerieux公司的VITEK2全自动鉴定系统鉴定。1.2药敏试验采用Etest法测定最低抑菌浓度(MIC)，全部操作与结果判断均严格按照2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准进行。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和产酶型大肠埃希菌ATC

6、C35218。1.3ESBLs和AmpC酶检测采用酶提取物三维试验方法，按照文献〔3〕操作，以肺炎克雷伯菌ATCC700603和阴沟肠杆菌029M分别作为ESBLs和AmpC酶阳性质控菌株跟随试验。试验所用药敏纸片和琼脂均为英国Oxoid公司产品。1.4细菌DNA的提取将平皿上过夜培养的受试菌落接种于5mlLB肉汤中，37℃振荡培养12～16h后，13000r/min离心1min收集沉淀(菌体)；采用赛百盛(SBSGeech)的硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒提取细菌质粒。1.5PCR扩增及序列分析β内酰胺酶耐药基因所用引物2

7、结果2.1药敏结果体外活性试验表明，4株肺炎克雷伯菌对阿米卡星、头孢吡肟、头孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦、头孢他啶、替卡西林/克拉维酸的MIC为256μg/ml，亚胺培南、环丙沙星MIC为32μg/ml，均为多重耐药。2.2耐药机制4株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌主动外排机制检测和ESBL、AmpC酶、β内酰胺酶基因检测、外膜蛋白表达情况见表1。4株肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药性均较高，但在含利舍平的平板上，其MIC值没有明显下降，根据文献资料判断为主动外排机制阴性。SDSPAGE进行外膜蛋白检测4株亚胺培南耐药株，加1株亚胺培表

8、14株肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药机制检测结果-：阴性；+：阳性。南敏感株作对照检测，发现耐药株全部在32500～47500分子量之间缺失一条带，从位置判断可能为OMP36000或OMP37000的一种外膜蛋白。3讨论肺炎克雷伯菌引起医院感染往往以耐药菌株为主，2