环孢素a对咖啡因间歇刺激下的l6细胞肌原纤维降解信号通路的影响

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1、DissertationSubmittedtoGuangzhouSportUniversityforMasterDegreeEffectsofcyclosporineAonthemyofibrillardegradationsignalingpathwayintheintermittentcaffeine-stimulatedL6cellsMasterCandidate:YangMingSupervisor:Liaoba-genJune,2011广州体育学院学位论文使用授权声明本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研

2、究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属广州体育学院。广州体育学院拥有在著作权法规定范围内学位论文的使用权，包括：（1）已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文；（2）为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所供校内师生阅读，或在校园网上供校内师生浏览部分内容；（3）学校有权向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版或纸质版，允许学位论文被检索、查阅和借阅。本人保证遵守上述规定。（保密的论文在解密后遵守此规定）作者签名：导师签名：日

3、期：日期：广州体育学院学位论文声明本人郑重声明：本人所呈交《环孢素A对咖啡因间歇刺激下的L6细胞肌原纤维降解途径的影响》是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：导师签名：日期：日期：摘要目的：本研究通过使用环孢素A抑制对大鼠L6肌管细胞钙调神经磷酸酶的活性，同时使用咖啡因模拟运动时骨骼肌细胞内的环境，观察环孢素A

4、对泛素-蛋白酶体系统信号的影响，探讨钙调神经磷酸酶是否影响正常状况以及运动时骨骼肌萎缩信号转导通路。研究方法：L6细胞分化8天后形成肌管细胞，然后随机分为四组：对照组，咖啡因组，环孢素A组，咖啡因+环孢素A组。每天药物刺激5小时，连续刺激5天。分别提取蛋白质和核酸，并将全部蛋白和mRNA样品分别调为同一浓度。然后荧光实时定量PCR检测FoxO1、MAFbx以及MuRF1的基因表达；Westernblotting检测FoxO1、MAFbx、MuRF1、20S蛋白含量；荧光定量法检测20S蛋白酶和钙蛋白酶的活性。研究结果：1.形态学

5、改变：未分化前，L6细胞成单核梭形。分化后变成多核线性的肌管细胞。经过5天的实验干预，加环孢素A的两组细胞大小明显小于另外两组，且咖啡因间歇刺激可以抵抗CsA诱导的肌管细胞萎缩。2.荧光实时定量PCR结果：慢性间歇刺激下，加咖啡因的两组FoxO1mRNA表达下调；MuRF1和MAFbx两个基因的表达在各组之间无差异。环孢素A并不影响它们的表达。3.Westernblotting结果:慢性间歇咖啡因/环孢素A刺激下,FoxO1/MuRF1/MAFbx和20S蛋白酶蛋白含量各组之间均无显著性差异。4.荧光定量酶活性检测结果：环孢素组

6、、环孢素A+咖啡因组胞浆钙蛋白酶活性均明显低于其余两组；与环孢素组相比，环孢素A+咖啡因组钙蛋白酶活性则明显上调；胞浆20S蛋白酶的活性各组之间均无显著性差异。结论：1.间歇咖啡因刺激明显抑制L6细胞FoxO1基因表达，但不影响MuRF1和MAFbx的表达。2.环孢素A对L6细胞泛素-蛋白酶体系统的相关信号分子无影响，即钙调神经磷酸酶不影响泛素-蛋白酶体系统。3.环孢素A抑制L6细胞钙蛋白酶活性，间歇咖啡因刺激减轻其抑制。关键词：L6细胞；泛素-蛋白酶体；咖啡因；环孢素A；钙蛋白酶IABSTRACTObjective:Thiss

7、tudyisbasedontheL6myotubeswhichweretreatedwithcyclosporineAtoinhibitcalcineurinactivity,atthesametime,thecaffeinewasusedtokeepasimilarcellularenvironmentduringexercise.Thus,theeffectofcyclosporinAontheUbiquitin-Proteasomesystemsignalswasobservedtodeterminewhethercalc

8、ineurininvolvedinskeletalmuscleatrophysignalingpathwaysduringnormalandexerciseconditions.Methods:AfterL6cellsturnedtomyotubesthroug