广州地区α地中海贫血的新生儿筛查与高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α地中海贫血筛查中的应用

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1、·缩略词表英文缩写英文全名中文译名CEcapillaryelectrophoresis毛细管电泳HbCSHbConstantSpring血红蛋白CSHbQSHbQuongSze血红蛋白QSHPLChigh-performanceliquidchromatography高效液相色谱法HRMhigh-resolutionmelting高分辨率熔解曲线分析PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应gap-PCRgap-polymerasechainreaction跨跃断裂位点聚合酶链反应RDBreversedotblotting反向斑点杂交SNPsingle

2、nucleotidepolymorphism单核苷酸多态性位点IEFisoelectricfocusing等电聚焦DHPLCdenaturinghigh-performanceliquidchromatography变性高效液相色谱法OFTosmoticfragilitytest渗透脆性试验····广州地区α-地中海贫血的新生儿筛查及高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α-地中海贫血筛查中的应用研究生：唐海深导师：李东至教授专业：妇产科学中文摘要α-地中海贫血(α-thalassemia，α-地贫)是α-珠蛋白基因缺失或突变使α-珠蛋白链的合成受到抑制而引起的遗传性溶血性贫血

3、，是人类最常见且危害最大的单基因遗传病之一，在我国主要集中在南方地区，广州是α-地贫的高发区。正常人有4个α基因，若4个α-基因都缺失(HbBart’s水肿胎)，胎儿一般在妊娠晚期或出生后数小时死亡。另外，一些非缺失型HbH病和非缺失型α-地贫纯合子患者贫血严重，甚至需要输血治疗。静止型和轻型α-地贫基因携带者自身无临床表现，但可能生育重型地贫的胎儿，因此，在α-地贫高发区进行人群筛查尤为必要。已有研究发现脐血中的HbBart’s与α-地贫直接相关，本研究应用全自动毛细管电泳技术(SebiaCapillarys2)对脐血进行HbBart’s定量，探讨其筛查α-地贫的效果。另

4、外，近年来兴起的一种遗传学分析方法——高分辨率熔解曲线技术(HRM技术)，用于基因突变扫描、基因分型等具有简单、快速、低成本等优点，本研究探讨HRM技术用于筛查非缺失型α-地贫的可行性。一、目的1.调查广州地区α-地贫的基因携带率及基因型频率。2.探讨新生儿脐血HbBart’s水平与α-地贫类型的关系。3.探讨高分辨率熔解曲线技术(HRM技术)用于筛查非缺失型α-地贫的可行性，建····立一种快速、简便、廉价的非缺失型α-地贫分子筛查方法。二、方法1.收集2010年5月至2011年7月我院产科分娩的6525例新生儿脐带血。2.应用全自动毛细管电泳技术对6525例新生儿脐血进

5、行HbBart’s定量。3.采用gap-PCR技术检测所有HbBart’s阳性样本和随机抽取的100例HbBart’s阴性样本α-地贫的3种常见缺失(--SEA、-α3.7、-α4.2)。4.对gap-PCR技术未检出异常，但HbBart’s%≧2%的样本，用一种快速可靠的多重PCR检测四种缺失(--THAI，--FIL，--MED，-(α)20.5)。5.对gap-PCR和多重PCR技术均未检测出异常的HbBart’s%≤2.5%的样本，用HRM技术筛查α-珠蛋白基因的第三外显子。6.用反向点杂交(RDB)技术检测上述样本的3种常见非缺失型α-地贫基因(αCSα、αQSα

6、和αWSα)。7.对于用以上方法均未知基因型的样本，用HRM技术筛查α-基因的第一、二外显子。8.用PCR产物直接测序法检测上述样本的α1-和α2-珠蛋白基因全长。三、结果1.在6525例新生儿脐带血样本中，检出HbBart’s阳性样本377例(阳性检出率为5.78%)，其中375例经基因分析确诊为α-地贫。本研究中共检出14种α-地贫基因型375例(含384个α-地贫等位基因)，α-地贫基因携带率为5.89%。其中东南亚缺失型(--SEA)基因携带率为4.03%，αCSα、αQSα基因携带率分别为0.18%、0.15%。2.脐血HbBart’s的含量与α-基因缺陷(缺失或

7、突变)的个数相关：1、2、3个α-基因缺陷的HbBart’s含量分别为0.55%±0.29%、3.54%±0.79%和20.27%±1.72%。3.随机抽取的100例HbBart’s阴性样本中，检出1例-α3.7/αα。····1.HRM技术筛查非缺失型α-地贫的敏感性和特异性均达100%。2.通过用PCR产物直接测序法检测α1-和α2-珠蛋白基因的全长，检出5例4种非缺失型α-地贫，其中2种是人群中没有报道的新发突变。四、结论1.证实了广州地区是α-地贫的高发区。2.以脐血HbBart’s阳性为指标，对新生儿进行