免疫组化原理及流程介绍

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1、免疫组化的原理及流程介绍主要内容免疫组化原理及流程介绍一.免疫组化的发展简史二.免疫组化的原理三.免疫组化的基本流程四.免疫组化的结果分析免疫组化原理及流程介绍一.发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。80年代Hsu等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学

2、分类方法迅速发展。2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。免疫组化原理及流程介绍二免疫组化的原理免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组化原理及流程介绍它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素

3、、病原体以及受体等)。三免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶3.抗原修复、暴露抗原决定簇4.封闭非特异性蛋白5.一抗孵育6.二抗孵育7.SP反应8.显色9.复染、脱水、透明、封片2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。60℃×20min→Xylene：2×10minutes；100%absoluteethanol：2×5minutes；95%ethanol2mi

4、nutes；80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；PBS洗3×3min。具体操作免疫组化原理及流程介绍2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。(1)细胞通透免疫组化原理及流程介绍(2)封闭内源性过氧化酶其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。1)用封闭通透液浸润切片30min（RT避光）。其配法是用预热40mlPBS加1

5、20ulTritonX-100加热几分钟，在临用前加400ul的30％H2O2。2)PBS溶液洗3次×3min。免疫组化原理及流程介绍具体操作:免疫组化原理及流程介绍3.抗原修复暴露抗原决定簇由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理及流程介绍常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。抗原修复的主要方法:酶消化方法一般用于细胞内抗原应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键免疫组化原理及流程介绍将切片放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6

6、.0）后，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止干片。2)PBS溶液洗3次×3min。具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍4.封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理及流程介绍将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温(约30℃)下10～30min。具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍5

7、.一抗孵育一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、