免疫组化的基本原理操作流程及注意事项

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1、免疫组织化学的概念底物抗原一抗酶免疫组化原理基本原理：抗原抗体反应即让抗原与抗体特异性结合，再通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)对其进行定位、定性及定量的研究.免疫组织化学技术的发展历史1940年，Coons免疫荧光技术，冰冻切片1974年，Taylor石蜡组织免疫组化技术20世纪90年代，Avrameas建立酶标技术，即辣根过氧化物酶标记特点：特异性强敏感性高定位准确、形态与功能相结合多克隆抗体（PcAb)：利用已知抗原免疫动物后所获得的免疫血清中所提取的免疫球蛋白。1890年抗毒素的出现，标志着第一代抗体－多

2、克隆抗体的产生。它的特异性相对低于McAb,但亲和力高。单克隆抗体（McAb):通过杂交瘤技术制备出的只针对一种抗原决定簇的抗体。1975年抗绵羊红细胞抗体的出现，标志着第二代抗体－单克隆抗体的产生。它特异性及纯度都比较高，但产量较低。免疫组化图片其他方法图片（WB法）常用的免疫组织化学技术方法免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、ABC法等）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法等）免疫荧光法直接法：用荧光素（FITC、TRITC等）标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，检测抗原。优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大应用：肾穿荧光素

3、抗体抗原间接法先用特异性的抗体1与标本上的抗原反应，再用荧光素标记的特异性抗体2（间接荧光抗体）与特异性抗体1相结合形成复合物。荧光素抗体1抗原抗体2补体法用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，在用抗补体的荧光抗体与之结合。双重免疫荧光法在同一个标本上检测两种不同抗原。即用两种不同抗体上分别标记不同颜色的荧光素，反应后每一种颜色表示一种抗原。免疫酶法原理与免疫荧光法基本相同，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物有特异行催化作用，生成有色的不溶性产物或者具有一定电子密度的颗粒，用于光镜或者电镜显示。能用于免疫

4、组化技术的酶主要有3种：辣根过氧化物酶（HRP）最常用、最实用碱性磷酸酶（AKP）能避免内源性干扰葡萄糖氧化酶（GOD）其形成的色素容易扩散，且分子量大容易聚集免疫酶法分类直接法用酶标记的特异性抗体直接与标本中抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反应的部位，即可以对抗原进行定性、定位甚至定量研究。加底物酶一抗抗原间接法先用特异性抗体（一抗）与标本中相应抗原反应，再用特异性酶标抗体（二抗）与结合在抗原上的一抗反应，加底物显色。注意动物种属关系：比如标本是人组织，一抗要用其它动物抗人的抗体如鼠抗人，二抗就要为兔抗鼠或者羊抗鼠。优点：用一种酶标抗体就可以与多种特异

5、性一抗配合而检查多种抗原，敏感性也大大加强。酶桥法用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改为酶与酶抗体免疫反应而结合的方法。避免了由于化学反应过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。PAP法将酶和抗酶抗体制成复合物（PAP）取代酶桥法中的抗酶抗体和结合的酶，缩短一步。APAAP法利用桥抗体将AKP连接在第一抗体的结合部位，而AKP和抗AKP被制成复合物（APAAP）。免疫金银法（IGSS）免疫金法用胶体金标记的间接抗体或A蛋白与特异性抗体结合，在光镜下就可见红色反应物出现。要求抗体浓度高，结果也不敏感。免疫金银法在前法的基础上加含银的显影液，使金离子周围形成很多沉淀，在光镜下就可以看到

6、棕黑色颗粒。从而提高敏感性，抗体浓度比前法也有一定下降。亲和免疫组织化学技术（affinityimmunohistochemistry）生物素（维生素H，Biotin）首先是从鸡蛋黄中分离出来的，广泛存在于动、植物中。分子量小约为244k，与卵蛋白有极强的亲和力，比抗原抗体的亲和力高100万倍！卵白素（Avidin）鸡蛋白中的一种碱性蛋白，性质稳定，与其它物质（如荧光素和酶）具有很高的亲和力。当与生物素结合后更加稳定，在很大pH范围类对许多蛋白酶都有耐受能力。过氧化物酶O（peroxidase)可以使DAB显色。Envision法原理：用多聚螯合酶（AP或者HRP）标记二抗IgG

7、，再与一抗结合。因为多聚螯合物上有大量的AP或者HRP分子，所以它比传统方法更加敏感，放大倍数更大（比ABC法、SP法高几十倍）。多聚物在人体内不存在，因此减少了非特异性，降低背景。免疫组化操作步骤：（以DAKO试剂盒为例）切片福尔马林固定石蜡包埋的组织，切片厚3-4微米，置60±5℃的烤箱中烤干（约2小时）脱蜡将已烤干的切片依次置于二甲苯I、II、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中