檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析论文

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1、檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析论文文海涛，赵红英，林励，邱贤秀【摘要】目的通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因。方法利用CTABLiCl法提取檀香已结香心材总RNA，采用RTPCR技术克隆萜烯合成酶基因。结果克隆获得了一个檀香萜烯合成酶基因，该基因编码区全长1731bp，编码576个氨基酸残基。结论CTABLiCl法能提取较高质量的檀香心材总RNA，克隆获得的萜烯合成酶具有编码区。【关键词】檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析Abstract:ObjectiveToclonetheterpenesynthaseg

2、enefromSantalumalbumL.enttheheartalbumL.AndRTPCRployedtoclonetheterpenesynthasegeneatthesametime.ResultsOneterpenesynthasegeneconsistedof1731bpnucleicacidSantalumalbumL.,inoacidresidues.ConclusionCTABLiCltreatmentcouldextracthighqualityRNAfromtheheartalbumL.,andtheclon

3、edterpenesynthasegenehadtheopenreadingframe.KeyalbumL.;terpenesynthase;genecloning;sequenceanalysis名贵中药檀香为檀香科植物檀香(SantalumalbumL.)的树干心材.freelalbumL.)心材，檀香树由广东省中药研究所邱金裕研究员鉴定为檀香科植物檀香SantalumalbumL.。采用钻孔取样的方式收集已结香部分心材，装入试管后迅速放入液氮罐速冻，取回后保存于-80℃冰箱。1.1.2试剂RNA提取试剂包括溶液Ⅰ与溶液Ⅱ，溶液Ⅰ:

4、2%CTAB,2%PVPK30,2mol·L-1NaCl，100mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)，25mmol·L-1EDTA(pH8.0)，0.5g·L-1亚精胺。溶液Ⅱ:0.5%SDS，1mol·L-1NaCl，10mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)，1mmol·L-1EDTA(pH8.0)，2种试剂均用DEPC水配制。反转录试剂盒：采用Takara公司的PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit。克隆试剂盒：采用北京天根生化科技有限公司的pGMT试剂盒。TaqDNA聚

5、合酶、dNTP、DNAMarker、T4DNALigase、限制性内切酶等均为Takara产品;引物合成和测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。其他试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1檀香心材RNA提取参照Chang等5方法进行提取并稍加改良。改良之处为用三氯甲烷/异戊醇(24∶1)抽提两次、用10mol·L-1LiCl沉淀过夜，其他不变。1.2.2反转录采用Takara公司PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反转录RNA成cDNA。步骤为：(1)在离心管中依次加入总RNA4μL，oligo(

6、DT)1μL，dNTP(10mmol·L-1)1μL，加RNasefreein，迅速取出冰上放置3min;(3)按顺序分别加入5×Buffer4μL，RNaseinhibitor0.5μL，RNasefreeeScriptRTase1μL，42℃保温1h，70℃灭活15min。于-20℃保存备用。1.2.3PCR扩增根据已登录NCBI的同源序列设计引物：F：5′TATGGATGCCTTTGCCACTTCTCCGACCTC3′;R：5′TTCAATCCTCCTCGTTCAGTGGAATAGGGT3′。PCR扩增体系：包括Premi

7、xLATaq25μL，引物F和R各2μL(10μmol·L-1)，模板cDNA2μL，补充ddH2O至总体积50μL。PCR扩增条件：94℃，4min;94℃，50s，59℃，50s，72℃，2min;34循环;72℃，10min。1.2.4基因克隆与序列分析扩增产物电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收产物定量后与克隆载体pGMT连接，转化大肠肝菌DH5α，蓝白斑筛选后挑取白色单克隆进行扩大培养，选取经酶切和PCR鉴定含有目的片段的克隆送英潍捷基公司测序，测序结果通过NCBI中BLASTn和DNAstar以及DNAssi

8、st软件进行序列拼接和比对分析。2结果与分析2.1檀香心材总RNA提取采用CTAB提取、LiCl沉淀法提取的檀香心材总RNA，经1.0%甲醛变性凝胶电泳后，结果如图1所示。从图1可以看出，提取的檀香心材总R