洛伐他汀合成酶调控基因love和mkh的克隆及其序列分析比较论文

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1、洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较论文黄欣朱碧云吕带弟陈伟立黄晓琳李浩明【摘要】目的克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH，并进行序列分析和同源性比较。方法根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为模板PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19Tsimple载体。利用DNAMAN等软件以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。结果分别扩增得到1512bp和1464b

2、p的目的片段lovE和mkH。结论lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中相关已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶调控基因，且其表达产物为GAL4类转录因子。【关键词】土曲霉红曲霉洛伐他汀转录因子调控基因洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一［1-3］，它可下调炎症相关转录因子的表达SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未显示典型的N端信号肽区域，SubLoc分别以84%，94%的精确度和RI=3，5的可靠性指数预测两蛋

3、白在核内。SignalP分析（SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未显示典型的N端信号肽区域，SubLoc分别以84%，94%的精确度和RI=3，5的可靠性指数预测两蛋白在核内。SignalP分析（.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测结果显示两蛋白均非分泌蛋白，且存在信号肽的可能性分别为10.4%和0。3.3.3疏水性分析疏水和亲水是氨基酸固有的特性，蛋白质结构的特征是疏水和亲水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用。疏水性预测和分析对于蛋白质次级结构

4、的预测及功能分析都有较为重要的参考意义。将测序结果递交到服务器.expasy.org/cgibin/protscale.pl采用kyte和Doolittle的方法得出两蛋白大部分氨基酸是亲水的，因此属于亲水蛋白。这也和signalP以及亚细胞定位分析预测结果一致为核内的非分泌蛋白，蛋白通过核孔复合体进入核内需要亲水基团的参与。3.3.4蛋白高级结构及功能分析蛋白质通常含有一些结构域和特殊的保守位点，而这样的结构涉及某种进化起源或者负责特殊的功能。将测序结果递交到自动比较同源蛋白建模服务器SODEL

5、.html)及PredictProtein(.predictprotein.org/)对lovE和mkH编码氨基酸序列进行高级结构分析。再通过VASTSearchStructure（.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述获得的pdb文件，其结果用Cn3D软件如图3所示：图3蛋白高级结构分析（A为lovE蛋白，B为mkH蛋白）（略）Figure3Advancedstructureanalysis（AforlovEproteinandB

6、formkHprotein）图3中两蛋白均具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域，该保守结构域发现于如GAL4型的转录因子，曾在酿酒酵母中证实GAL4为半乳糖诱导的基因表达正调控子。此结构域由2个α螺旋环绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参与Zn依赖性的DNA结合）并由无规则卷曲串联起来。该类结构域还涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、麦芽糖和半乳糖的代谢，以及酰胺和α氨基丁酸的降解与亮氨酸的生物合成等。4讨论洛伐他汀是目前治疗高血脂症的常用药物之一。国内工业化生产洛伐他汀的效率并不理想，

7、以致研究者们纷纷以增产洛伐他汀为目标开展多方面的研究。目前从基因工程方面着手改善其产量成为热点。本文克隆的lovE和mkH基因编码产物是一个洛伐他汀生物合成的调控蛋白或转录因子，对其深入研究将有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等将lovE基因突变失活导致检测不到任何洛伐他汀中间产物，同时将一个额外拷贝的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增加5～7倍［10,16］。从上述数据可以看出对lovE和mkH基因以及其编码蛋白的结构功能的进一步研究将为深入理解洛伐他汀生物合成及其遗传调控

8、方面提供参考，且为进一步表达基因、纯化相关蛋白、制备多克隆抗体、研究基因体外转录、转录因子与DNA的体外模拟结合以深入了解该类转录因子生物学功能和作用机理奠定了实验基础。本研究利用国际互联网生物信息学资源，通过计算分析两蛋白物理化学特性，得知此两核蛋白和一些转录因子以及调控序列编码产物有共同的GAL4类锌指结构保守序列区。相似性搜索比对得知lovE和mkH不论基因还是编码产物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA结合保守序列。【