简论牛igg2fc受体(bofcγ2r)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

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1、简论牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达【摘要】　　目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RTPCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEMTEasy,经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET2R,转化E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得6

2、82bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET2R转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30000的重组蛋白。SDSPAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,orton等[6]证明boFcγ2R的EC1区是亲和IgG2Fc的特异结构功能区,2006年Zhang等[7]又将boFcγ2R的线性配体结合表位精确定位于EC1区FGloop的4肽区域。这些发现对于探索反刍动物免疫调节的

3、分子机制,及开发新药和新药靶的研究提供新的思路。为了进一步研究这一新型受体和IgG的相互作用机制及其介导的免疫反应,我们用RTPCR技术扩增了boFcγ2R的胞外环区并在大肠杆菌中进行了表达。　　1材料和方法　　1.1材料pGEMTEasyVectorSystemⅠ、EZspincolumntotalRNAisolationkit、限制酶EcoRI和NotI、T4DNA连接酶购自promega公司;pET28aVector、E.coliJM109和E.coliBL21(DE3)均购自宝生物工程（大

4、连）有限公司;AEC(3Amino9ethylcarbazole)显色试剂盒为华美生物公司产品。　　1.2方法　　1.2.1引物设计参照张改平发表的牛Fcγ2R的基因（Z37506）核苷酸序列利用引物设计软件Primer5.0设计了一对引物:上游引物B11:5′CCGGGAATTCAGTGTGGGCCTAAGGA3′,下游引物B12:5′TTTAGCGGCCGCCCGGATGAGATTCTGC3′,由大连宝生物生物工程公司合成。为便于基因的克隆及构建表达载体等后续工作,在引物中引入Eco

5、RI、NotI酶切位点。　　1.2.2总RNA的提取和RTPCR从新鲜抗凝牛血中分离牛白细胞,用EZspincolumntotalRNAisolationkit提取总RNA,以B11、B12为引物,按照RTPCR试剂盒操作手册对boFcγ2R基因进行RTPCR扩增,反应体系如下:RNaseFreeV/Tf15×ReactionBuffer10μL,dNTPMix(10mmoldNTP)1μL,Dostreamprimer1μL（50pmol）,Upstreamprimer1μL（50pmol）

6、,25mmol/LMgSO42μL,AMVReverseTranscriptase1μL,Tf1DNAPolymerase1μL,RNAsample10μL,Finalvolume50μL。第1链cDNA合成参数为48℃反转录45min。第2链合成时先在94℃预变性2min,同时灭活AMV反转录酶;然后进入以下40个循环:以94℃变性0.5min,60℃退火1min,68℃延伸2min;循环完毕后68℃继续延伸10min。将RTPCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,并回收目的片段。　　1.2.3

7、目的基因的克隆与测序将回收、纯化的目的基因片段与pGEMTEasy载体于16℃连接过夜,次日转化到JM109感受态细胞中,提取质粒酶切鉴定和序列测定。　　1.2.4重组表达载体的构建和鉴定将克隆到T载体上的阳性质粒经EcoRI和NotI双酶切,获得的目的片段插入表达载体pET28a相应酶切位点,重组pET28a转化表达菌BL21（DE3）,挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定,并命名为pET2R。　　1.2.5重组蛋白的表达将阳性重组质粒转化BL21(DE3)表达宿主菌中,挑取单菌落,接种到5mLLB（

8、含50mg/L卡那霉素）培养液中37℃振荡过夜培养,次日以1%的接种量转入5mL的LB培养液（含50mg/L卡那霉素）中,培养至A600=0.6左右时,加IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导,再于37℃培养3～6h,4000r/min离心20min收集菌体,用含100mg/L溶菌酶的PBS重悬菌体,经超声波裂解后,4℃12000r/min离心15min,分离细胞裂解液上清和沉淀,以SDSPAGE鉴定表达结果。　　1.2.6illipore)上点印