土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定论文

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1、土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定论文【摘要】目的对土壤来源的Streptomycessp.3423代谢产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化和结构鉴定。方法采用MTT法，以对K562细胞的抑制活性为指标，筛选活性菌株。发酵培养液经各种色谱技术分离纯化，并通过对其理化性质、质谱、紫外、红外和核磁共振等图谱数据分析，确定化合物的结构。结果和结论Streptomycessp.3423代谢产物中分离得到6个已知化合物。生物学活性研究发现化合物3，4对K562细胞具有抑制活性，其中化合物4活性最强，IC50为14.1μg/ml。【关键词】土壤放线菌环二肽抗肿瘤活本实验室

2、建立了K562细胞和对格列卫耐药的K562细胞体外筛选模型［1］.freelasil色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，配备UV230+型UVVIS检测器，制备型高效液相色谱仪(大连依利特公司)Spherisorb色谱柱(10mm×250mm，10μm)；核磁共振谱(Varian，Inova600x型核磁共振仪)；质谱(MicromassZabspec型质谱仪)；制备薄层(HSGF254烟台化工研究院)；反相硅胶ODS(J.BAKER)；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产；所用试剂为分析纯。实验菌株是分离自我国江苏地区土壤的放线菌，分离保存方法见文献［1

3、］，本实验选择菌株代号为3423。1.2发酵首先将菌种涂布于平面培养基［成分(%)：可溶性淀粉1，葡萄糖2，牛肉膏0.1，酵母提取物0.4，NaCl0.2，K2HPO40.025，CaCO30.2，琼脂1，pH=7.2］上，30℃培养6d，挑取多个单克隆菌落接种于种子培养基(成分同平面培养基)上，30℃培养48h，显微镜下观察菌体形态，选择较好的一株作为菌种接种于发酵培养基(成分同种子培养基)，于摇瓶中振荡培养(250ml/500ml)，30℃培养72h。发酵终点pH为6.8左右。1.3提取发酵液经离心得到菌丝体和上清液，菌丝体经丙酮浸泡12h、过滤、减压浓缩至无丙酮，

4、乙酸乙酯提取三次；上清液加入AB8大孔吸附树脂，搅拌吸附8h，过滤，AB8用丙酮解吸附，减压浓缩至无丙酮，加等体积乙酸乙酯提取两次；合并菌丝体及发酵液的乙酸乙酯提取液，经无水硫酸钠干燥、过滤和减压浓缩至褐色浸膏(2g)。1.4分离与纯化初提物(1.8g)采用C18反相色谱分离，以55%甲醇洗脱，收集流份以TLC分析结果进行合并，得到11个组分(A1～A11)。A1(119mg)再经过硅胶柱层析，制备正相薄层色谱纯化(氯仿∶甲醇=40∶1)，得到化合物I；A4(414mg)经过硅胶柱层析分离，采用反相HPLC制备色谱纯化(60%甲醇)，得到化合物II；A7(193mg

5、)经过制备HPLC得到化合物III(18mg)；A9经过制备薄层色谱和凝胶过滤得到化合物IV；A10(75.9mg)经过正相制备薄层层析(氯仿∶甲醇=100∶0.7)得到化合物V(8mg)和B10两个组分，B10再经过反相HPLC制备色谱纯化(55%甲醇)得到化合物VI(8.8mg)。1.5活性测定将各化合物配制成不同浓度的溶液，加入K562细胞中。K562细胞系用含10%小牛血清PRMI1640培养液，37℃，通入5%CO2的培养箱中培育72h，加入20μlMTT溶液，继续孵育4h，吸去细胞悬液，加入120μlDMSO溶解沉淀物，酶标仪490nm下测定其光密度值。2

6、结果与讨论2.1结构鉴定化合物I分子式C7H10O4，1HNMR(CDCl3)δH4.5(1H，dd，10.8Hz，6.6Hz)，4.3(1H，dd，13.8Hz，6Hz)，3.9(1H，dd，13.8Hz，10.8Hz)，3.7(3H，s)，2.1(3H，s)，数据与文献报道一致［2］，经鉴定为6甲基3羟基5甲氧基2.3二氢吡喃4酮。化合物II分子式C15H18N2O2，1HNMR(DMSO)δH8.2(1H，s)，9.7(1H，s)，7.22(2H，d，7.2Hz)，7.2(2H，dd，8.2Hz，7.0Hz)，7.11(2H，d，8.2Hz)，

7、5.25(1H，d，10.4Hz)，4.29(1H，dd，4.0Hz，4.9Hz)，3.11(1H，dd，4.0Hz，13.7Hz)，2.89(1H，dd，4.9，13.7)，2.6(1H，dqq，6.4Hz，10.4Hz)，0.83(3H，d，6.4Hz)，0.7(3H，d，6.4Hz)。数据与文献一致［3］，鉴定为3苄基6亚异丁基哌嗪2，5二酮。化合物III分子式C16H18N2O2，1HNMR(CDCl3)δH8.01(1H，s)，7.43(2H，t，7.2Hz，7.8Hz)，7.38(2H，d，7.8Hz)，7.33(