caveolin-1-shrna慢病毒的构建及其对tnf-α致大鼠pmvec损伤影响

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1、...............1......*本研究系国家自然科学基金资助项目（No.81070054）英文缩略词表Abbreviation英文缩写英文全名中文全名ALIacutelunginjury急性肺损伤ARDSacuterespiratorydistresssyndrome急性呼吸窘迫综合征BIMbis-indolylmaleimide双吲哚基顺丁烯二酰亚胺BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白Cavcaveolin小窝Cav-1caveolin-1小窝蛋白-1DEPCdiethylpyrocarbonate二乙基焦磷

2、酰胺DMEMDulbecco′smodifiedeagle′smedium改良Eagle氏培养基EBehtidiumbromide溴化乙锭EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸FBSfetalbovineserum胎牛血清FITC-BSIfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸标记的植物凝集素phytohemagglutininGAPDHglyceraldehydephosphate甘油醛-3-磷酸脱氢酶dehydrogenaseGFPgreenfluorescentprotein绿

3、色荧光蛋白Hhour小时HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶ISHinsituhybridization原位杂交......2......LPSlipopolysaccharide脂多糖Minminute分钟MAPKmitogen-activatedproteinkinase促分裂原活化蛋白激酶英文缩写英文全名中文全名mRNAmessengerribonucleicacid信使RNAPBSphosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PK

4、CproteinkinaseC蛋白激酶CPKAproteinkinaseA蛋白激酶APTKproteintyrosinekinase蛋白酪氨酸激酶PMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物PMVECpulmonarymicrovascular肺微血管内皮细胞endothelialcellROCKRho-associatedcoiled-coilproteinRho相关激酶kinaseRNAribonucleicacid核糖核酸RPMVECratpulmonarymicrovascular大鼠肺微血管内皮细

5、胞endothelialcellRT-PCRreversetranscriptPCR逆转录PCR SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠 Ssecond秒SPSSStatisticalpackageforsocialscience社会科学统计软件包 SSCstandardsalinecitrate标准柠檬酸盐缓冲液 Tabtable表TEMEDN,N,N',N'-tetramethylethylenediamine四甲基二乙胺 TERtransendothelialelectricalresistance跨内皮细胞单层

6、电阻 TNFtumornecrosisfactor肿瘤坏死因子......3......Caveolin-1-shRNA慢病毒构建及其对TNF-α致大鼠PMVEC损伤的影响摘要目的构建caveolin-1基因RNA干扰慢病毒，观察抑制caveolin-1基因表达后对大鼠肺微血管内皮细胞通透性的影响。为进一步研究caveolin-1在ALI/ARDS发病机制中的作用奠定实验基础。方法体外分离培养RPMVEC；采用RT-PCR及Westernblot检测RPMVEC中caveolin-1的表达；选定大鼠caveolin-1基因RNA干扰的靶序列，

7、合成靶序列DNA，退火成双链后与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7连接；重组pLL3.7-caveolin-1慢病毒载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒后，经限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ酶切鉴定后进行测序鉴定；慢病毒载体质粒pLL3.7和包装质粒VSV-G,RSV-REV,pMDL在脂质体2000的介导下共转染包装细胞293T细胞，包装慢病毒，病毒上清经浓缩后，按一定比例稀释后感染293T细胞，荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达，测定病毒滴度；通过Westernblot检测Caveolin-1shRNA慢病毒感染R

8、PMVEC后对caveolin-1基因表达的抑制；通过检测跨内皮细胞电阻观察caveolin-1基因表达抑制对TNF-α所致RPMVEC单层通透性增高的影响。结果1