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1、GDF15在口腔鳞癌中的作用机制和临床意义-->前言当今社会，癌症是威胁人类健康及生命的重要致死因素之一。据2012年统计，世界范围内每年新发癌症患者14,090,000例，因癌症死亡人数为8,201,000人，口腔癌每年新发病患者300,373例，死亡145,328例，男性患者中口腔癌发病率居第11位；在中国每年新发癌症患者3,065,000例；每年因癌症死亡2,206,000例；口腔癌每年新发病例21,413例，其中13,656例为男性并有7,370例死于口腔癌，7,757例为女并有3,96
2、3例死于口腔癌[1]。口腔黏膜鳞状细胞癌（OralSquamousCellCarcinoma,OSCC）是口腔癌中最常见的类型，预后较差。尤其是晚期口腔鳞状细胞癌患者，因其晚期阶段易淋巴转移及远处转移，且原发灶局部涉及多个重要器官，使肿瘤扩大切除的安全缘受限，即便通过手术、放疗、化疗及生物治疗的综合序列治疗，其5年生存率仅为20%-40%[2,3]。肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，口腔鳞状细胞癌亦如此；环境对机体的作用及机体自身的变化导致了口腔黏膜从正常口腔鳞状上皮细胞到过角化
3、、不同程度的异常增生，再到原位癌、侵袭性癌的演变过程（图1）[4]。吸烟、嗜酒及咀嚼烟草槟榔是导致口腔癌的主要致病因素[5,6]，因口腔癌（包括口咽癌）致死的患者中42%有吸烟史，而16%有嗜酒史，在台湾和东南亚，咀嚼烟草槟榔是口腔癌的主要致病因素[7-9]，而HPV感染与口腔癌的相关性近年来不断得到证实[10-15]。口腔鳞状细胞癌发生发展过程中涉及多种不同基因从染色体、RNA、蛋白等多个层次多种方式的改变，然而其确切的发生发展机制还不明确，寻找出肿瘤可能的危险因素并进行针对性预防可降低疾病的
4、发病率；通过分析筛选出的生物分子标记物的表达与肿瘤各个临床特征间的相关性，分析其作为诊断或预后预测标记物的可行性，有望更早的发现肿瘤或指导制定针对患者个体的个性化治疗方案；通过体内体外实验对肿瘤的各个阶段进行研究，期望发现瘤发生发展中的关键环节，并以恰当的方式进行干预，可能提高肿瘤患者的预后；因此，早期口腔鳞癌的诊断标志物，疾病的发生发展机制、疗效及预后评估指标的研究是当下研究的热点。肿瘤的体外癌变模型是研究肿瘤发生发展的重要手段。HPV病毒对口腔鳞癌发生的作用最先由Syrjanen等人报道[1
5、6]，并在后期的研究中被不断证实[17]。Termine等通过meta分析对4852例口腔鳞癌患者进行系统性回顾研究证实：24.1%的OSCC患者有HPV感染(95%CI,16.8–31.4%)，其中HPV16和HPV18的感染率分别为68.2%和34.5%[18]。许多文献证实将HPV病毒DNA导入正常上皮细胞的DNA序列可使细胞永生化[19-21]，本课题组前期研究中，我们通过转染HPV16E6/E7基因片段到正常口腔黏膜上皮细胞使其转变为人永生化上皮细胞（humanimmortalized
6、oralepithelialcell(HIOEC)line）[22]。然而HPV16病毒基因序列单独作用仅仅可使口腔上皮永生化，并不会导致细胞恶变。口腔癌的发生与烟草的关系已被反复证实，苯并芘在其中起了重要作用[23,24]。苯并芘是一种常见的致癌物，广泛存在于煤焦油，煤、石油等燃烧产生的烟气、香烟烟雾、汽车尾气中，以及工业污水中，然而已有文章证实苯并芘单独作用亦无法导致口腔上皮癌变[25]。在前期的工作中，本课题组通过苯并芘诱导HIOEC细胞，使其逐步癌变，变为口腔鳞状上皮癌细胞：HIOEC-
7、B(a)P-96简称HB96细胞。HIOEC细胞经苯并芘诱导，从第56代细胞开始细胞成瘤，命名为HIOEC-B(a)P-56简称HB56。而从第96代细胞开始出现较差的分化且在组织病理学上同典型的鳞状细胞癌近似，命名为HIOEC-B(a)P-96简称HB96细胞[26]。………第一章：生长分化因子15在口腔鳞状细胞癌癌变模型及口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达在前期课题组的工作中，我们通过基因芯片筛选出由口腔黏膜永生化细胞系HIOEC细胞逐步癌变成为口腔鳞状细胞癌细胞系HB96细胞过程中的差异基因，其
8、中GDF15在癌变过程中表达逐渐增高。然而基因芯片存在一定概率的假阴性或假阳性，并且体外建立的癌变模型与体内肿瘤形成过程及肿瘤细胞系存在一定的差别，因此有必要以更多的方法在多种肿瘤细胞系中进一步验证GDF15的表达。本章就GDF15在口腔黏膜上皮癌变模型和口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平进行进一步验证，为后续研究打下基础。1.1材料与方法1.1.1口腔粘膜癌变模型细胞系及口腔鳞状细胞癌细胞系的培养1.1.1.1试剂耗材及培养仪器恒温细胞培养箱：日本SANYO公司倒置显微镜：日本Nikon公司Sa
