GRK2、SSeCKS在血管紧张素Ⅱ诱导大鼠肾损伤过程中的作用

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1、-上海交通大学医学院硕士毕业论文多聚甲醛粉剂sigma公司二甲苯苏木素伊红3.仪器国产代谢笼透射电镜PHILIPCM-120型光学显微镜Olympus电子天平脱水机Shandon美国包埋机Shandon美国切片机SLEE4℃冰箱海尔70℃烤箱二、方法1.动物模型制备1.1AngⅡ药物缓释泵的制作称取AngⅡ粉剂4mg，0.9%生理盐水2ml将其溶解，配制成浓度为2mg·ml-1的AngⅡ溶液。在无菌操作台，使用0.22μm滤器对AngⅡ溶液进行灭菌消毒。将处理后无菌的AngⅡ溶液注入到ALZET2001型药物缓释泵中，将制备好

2、的药物缓释泵置于0.9%生理盐水中保存，12h后待其释放速度已达到稳定，即可用于接下来的动物模型实验，整个过程均在无菌条件下进行。1.2大鼠体内植入药物缓释泵制作动物模型26只150g±5gSPF级雄性Wistar大鼠，经适应性饲养2天，随机分为模型组(modeln=10)、假手术组(shamn=10)和正常对照组(normaln=6)。所有大鼠自由摄取标准饲料及水。取模型组大鼠，称取重量，按100g体重需0.4ml10%水合氯醛的比例麻醉大鼠，固定大鼠于操作台，大鼠取俯卧位，背部备皮，75%酒精消毒背部皮肤，在大鼠背部做一长

3、度为1.5cm的横切口，深达皮下，止血---2---上海交通大学医学院硕士毕业论文钳分离切口周围皮下组织。将含有AngⅡ溶液的药物缓释泵沿横切口塞入背部皮下，将释放药物的端口远离切口处，大体固定缓释泵位置，缝合切口，75%酒精消毒，3M手术贴膜覆盖切口，观察大鼠心跳、呼吸正常，手术结束。按此方法，依次完成模型组其他大鼠手术操作。假手术组大鼠背部皮下埋入含有0.9%生理盐水的药物缓释泵，其他操作与模型组相同。正常对照组大鼠不经任何处理。全部手术顺利结束，所有大鼠均正常存活。3.取材及标本的处理在处死大鼠的前一天，将所有大鼠放入代

4、谢笼中饲养。在埋入缓释泵的3天后，处死各组大鼠，留取当日的24h尿液。具体操作如下：计量各个大鼠24h尿液总量，取其中部分在低温下保存。称取大鼠重量，水合氯醛麻醉大鼠，固定大鼠于操作台，大鼠取仰卧位，消毒腹部皮肤，打开腹腔，分离左右侧双肾，快速打开胸腔，右心室进针采血，取2ml血于低温保存。在右心房剪开一缺口，从左心室灌注50ml的0.9%生理盐水，观察双肾颜色由暗红转为灰白证明灌流冲洗成功，取下双肾，冰上将肾皮质组织分成若干份，部分置于4%多聚甲醛固定用于HE染色和免疫组化，部分置于3%戊二醛固定用于透射电镜观察，部分置于4

5、%多聚甲醛+10%蔗糖混合溶液固定脱水用于免疫荧光检测，其他则置于液氮中保存用于后续的分子生物学实验使用。1.检测各组大鼠24h蛋白尿定量及血肌酐、尿素氮值将收集的各组大鼠24h尿液和血液立即送上海市第九人民医院检验科进行24h蛋白尿定量及血肌酐、尿素氮检测。采用磺基水杨酸法进行24h蛋白尿定量测定。3．观察肾脏组织结构改变1.1常规伊红-苏木素染色（HE染色），具体步骤如下：1）70℃烤箱中烘烤切片30min；2）将切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min脱蜡——100％、95％、75％乙醇溶液漂洗——苏木素染核10min—

6、—盐酸酒精分化15s——流水冲洗30min——伊红染胞浆2min——梯度酒精脱水——二甲苯透明——中性树脂封片；3）光镜下观测大鼠肾脏病理改变。1.2透射电镜观察大鼠肾组织超微结构改变---3---上海交通大学医学院硕士毕业论文3%戊二醛固定的大鼠肾组织送上海交通大学医学院电镜室进行电镜观察，具体操作如下：1）前固定：2%戊二醛固定2h4℃；2）漂洗：PBS洗涤10min×2次4℃；3）后固定：1%锇酸PBS固定2h4℃；4）漂洗：PBS洗涤10min×2次4℃；5）脱水：酒精梯度脱水；6）置换：环氧丙烷10min×2次；7）

7、浸透：环氧树脂618与环氧丙烷按不同比例进行浸透37℃；8）包埋：60℃烘箱内48h；9）切片：LKBV型超薄切片机切片；10）染色、观察：枸橼酸铅电子染色，PHILIPSCM-120型透射电镜观察。3.统计学处理数据以⎯x±s表示,采用SPSS17.0软件进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示有统计学差异。三结果1.造模后大鼠的基本状况埋泵后第2天，模型组和假手术组大鼠背部切口已完全愈合，未出现感染表现。此后，每天观察各个大鼠饮食量、摄水量、活动度、外观、体重变化等反映大鼠基本健康状况的指标，未发现异

8、常。2.各组大鼠24h尿蛋白定量及血肌酐、尿素氮水平模型组大鼠24h尿蛋白定量较假手术组和正常对照组均有明显增加（P<1.1）。假手术组大鼠24h尿蛋白定量与正常对照组相比无统计学差异（P>0.5）。三组大鼠血肌酐值及尿素氮值之间无明显统计学差异（P>0.05）(表1)（图1