抗菌肽高效表达策略及活性分析

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1、-摘要摘要利用基因工程手段生产抗菌肽的过程中，由于抗菌肽对宿主细胞会产生毒性使得蛋白表达受到影响，而改变融合头是使抗菌肽高效表达策略之一。本实验利用实验室已经成功构建并保存的工程菌，分析其诱导后OD600的变化以及不同融合头对G13毒性的影响。实验对pET28a-G13进行突变，以改变G13的N端融合头净正电荷数。设计突变引物，以质粒pET28a-G13为模板，PCR扩增序列，构建突变体pET28a′-G13，并进行诱导。对共表达工程菌在不同的抗生素比例下进行诱导，Tricine-SDS-PAGE电泳检测，比较分

2、析抗生素比例对蛋白表达的影响，同时比较抗生素比例不同质粒的拷贝数的变化。试验发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及其氨基酸分布有关。此外，针对本实验室已经摸索出的重组G13结构域的表达的方法进行改良，通过改变溶解蛋白的变性剂，以及改变其浓度等方法，希望能够减少尿素对重组肽的修饰。而且，在对纯化得到的G13进行了初步的检测之后，对于G13的活性研究进行了扩展，进一步研究G13结构域的溶血活性作用并对结果进行统计分析。另外本实验对抗菌肽vgf-1的表达和活性进行了初步研究。通过对NCBI蛋白质数据库的检索查询

3、找到了一个从眼镜蛇蛇毒中提取的具有抗结核杆菌效用的小肽Vgf-1。根据Vgf-1氨基酸序列和大肠杆菌的密码子偏好性，得出Vgf-1的基因序列。设计采用重叠PCR的方法得到基因序列。分三步扩增Vgf-1的基因片段(A,B,C)，这三个片段经过胶回收后分别均与表达载体pBAD/TOPO连接，转化感受态细胞E.coliTOP10，经过测序鉴定，分别命名为pBAD-Vgf-1-A,B,C。用阿拉伯糖诱导4h，经超声破碎处理后，SDS-PAGE电泳检测，融合蛋白的位置正确，且可以看出大多数目的蛋白以包涵体的形式存在。用Br

4、adford方法测菌体总蛋白量，用Bandscan软件分析融合蛋白的表达量分别约占总体蛋白量的58.3%、48.7%和45.5%，因此推算出推算每升工程菌发酵液产生的包涵体约为178mg、142mg和124mg。对所得到的融合蛋白pBAD-Vgf-1-B,C进行肠激酶切割体系的优化，得出最佳的肠激酶切割体系。利用最佳体系对融合蛋白进行切割，经过活性检测发现，目的肽没有抑菌活性。实验尝试利用各种比例的GSH/GSSG---I---抗菌肽高效表达策略及活性研究复性体系对包涵体进行复性，浓缩后进行肠激酶切割，结果发现复

5、性未能帮助得到有活性的蛋白。后采用先对融合蛋白进行切割，再进行复性的实验方案，试验结果表明仍为获得有活性的蛋白。关键词：毒性，融合头，溶血活性，蛇毒抗菌肽Ⅱ---AbstractAbstractThetoxicityofrecombinantantimicrobialpeptidesuponthehostcellaffectsthelevelofproteinexpressioningeneticengineering.Oneofthestrategiestoachievehighexpressionischan

6、gingthefusionpartners.Inthisstudy,weanalyzetheOD600oftheengineeringbacteriaandtheeffectsofdifferentfusionpartnersontheinhibitionofthetoxicityofG13.Wemutatedthegene sequenceofthefusionpartnersofpET28a-G13,thechargeofthefusionpartnersof themutantwaschangedinthe

7、N-terminalofG13.Wedesignedthemutationprimers. APCRreactionwasconductedwiththeprimersandpET28a-G13astemplate.The mutatedrecombinantnamedpET28a'-G13andinducedbyIPTG.Thedouble transformedcellsareinoculatedtodifferentratiosofantibiotic,toexaminethetarget proteinp

8、roteinexpressionlevelandthecopynumbersoftheplasmids.Itwasfound thattheinhibitioneffectofthefusionpartnerswasgreatlyaffectedthenetnegative chargeandtherelativelocationoftheacidicaminoacidr