基因工程抗菌肽表达条件的优化及生物活性试验

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1、动物医学进展，２００９，３０（１１）：６２６７ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ基因工程抗菌肽表达条件的优化及生物活性试验王秀青１，朱明星２，张爱君１，丁淑琴１，杨风琴１（１．宁夏医科大学检验系，宁夏银川７５０００４；２．宁夏医科大学实验动物中心，宁夏银川７５０００４）摘要：探讨表达条件对重组抗菌肽表达量和抗菌活性的影响。选用ＳＭＤ１１６８毕赤酵母菌株表达ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ及其串联体基因和ｃｅｃＡｍａｇ（ｃｅｃｒｏｐｉｎＡ前８个碱基和ｍａｇａｉｎｉｎ的第９个碱基）的３个突变体基

2、因抗菌肽。对６种重组酵母菌的摇瓶发酵条件，如ｐＨ、发酵温度、甲醇的添加量等进行了优化，结果优化后的表达条件可提高重组抗菌肽的表达量和抗菌活性。并从抑菌试验、酸碱稳定性试验、热稳定性试验、体外稳定性试验探讨了其生物学活性。关键词：摇瓶发酵；表达优化；重组抗菌肽；生物学活性中图分类号：Ｓ８５２．４；Ｓ８５２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００７５０３８（２００９）１１００６２０６抗生素的滥用不仅导致了药物残留等公共卫生提供，鸡致病性大肠埃希菌（Ｏ１）、金黄色葡萄球菌隐患，而且由于耐药性菌株的出现，使细菌性

3、疾病的（ＣｏｗａｎＩ）、鸡伤寒沙门菌（犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪犵犪犾犾犻狀犪狉狌犿）、防治比较困难。一种全新抗菌药物的开发已经成为鸡白痢沙门菌（犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪狆狌犾犾狅狉狌犿）、致脓性金黄色当代微生物学家、医药学家和兽医工作者的主攻课葡萄球菌（犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犪狌狉犲狌狊）和大肠埃希菌题。抗菌肽由于其广谱高效抗菌活性及独特的抗菌ＤＨ５α由南京农业大学农业部动物疾病预防重点实验［１］机制而在新型抗菌药物研究中显露明显优势。关室保存。其他供试验的主要菌株均由天津瑞普生物于抗菌肽的表达研究，不论是

4、在微生物中表达，还是制药公司提供，分别为标准株：大肠埃希菌、金黄色葡在植物、昆虫中表达，表达量都偏低，这成了抗菌肽萄球菌、枯草杆菌、短小杆菌、八叠球菌、鸡白痢沙门产业化的瓶颈因素。笔者选用犘犻犮犺犻犪狆犪狊狋狅狉犻狊系统菌等，临床上分别从山东、吉林、天津、南京分离到的ＳＭＤ１１６８蛋白酶缺陷菌株成功表达了６种抗菌肽耐氨苄青霉素的大肠埃希菌共１５株。基因，并进行了抗菌活性测定，验证其对金黄色葡萄１．１．２主要试剂ＳＤＳＰＡＧＥ低分子质量Ｍａｒｋｅｒ球菌、大肠埃希菌的杀伤活性。一种新药的上市，必购于生星生物

5、公司；ＳＤＳＰＡＧＥ超低分子质量须经过一系列临床试验的验证，证明其具有良好的Ｍａｒｋｅｒ（Ｃ６２１０）、Ｔｒｉｃｉｎｅ和Ｔｒｉｓ购于Ｓｉｇｍａ公司；活性、稳定的制剂、适宜的生产方法、体内稳定性和［２］Ｚｅｏｃｉｎ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｄ葡萄糖、Ｄ山梨醇、安全性等。而对于抗菌肽来说，目前还没有关于这方面的完整资料。本文对抗菌肽重组酵母菌进行ｐｅｐｔｏｎｅＹ、酵母提取物、酵母氮源基础培养基（Ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ，ＹＮＢ）、生物素等购于美国表达优化，并以得到的足量重组抗菌肽进行抗菌

6、生物活性和理化特性的相关研究。ＢＢＩ公司；其他试剂均为分析纯。１．２方法１材料与方法１．２．１６种基因工程重组酵母菌的表达优化１．１材料１．２．１．１高效表达菌株的选取将电转化结束后１．１．１质粒、受体菌、指示菌株６种基因工程抗菌的重组ＳＭＤ１１６８菌液，取１００涂布于含肽酵母重组质粒由笔者构建并保存，ＳＭＤ１１６８购于μＬＴＭ的ＹＰＤＳ／Ｚ＋固体选择培养基１００μｇ／ｍＬＺｅｏｃｉｎＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。指示菌株金黄色葡萄球菌（ＡＴＣＣ２６００３）Ｋ８８（Ｃ８３９０３）、Ｋ９９（Ｃ８３９１４），金黄

7、色葡上，２８℃培养２ｄ～４ｄ，转化子出现。将具有ＺｅｏＴＭ抗性的最初转化子菌落，通过影印法克隆到萄球菌（８８５／Ｃ５６００５），牛无乳／停乳链球菌ｃｉｎ（犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊犪犵犪犾犪犮狋犻犪犲／犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊犱狔狊犵犪犾犪犮狋犻犪犲）ＭＭ平板和ＭＤ平板上，２８℃培养３ｄ，挑选在两种培养基上均生长良好的Ｍｕｔ＋菌落，进一步依次转（Ｃ５５９０１和５８８／Ｃ５５９３５）由中国药品生物制品鉴定所收稿日期：２００９０６１５作者简介：王秀青（１９７９－），女，内蒙古凉城人，讲师，博士，主要

8、从事分子病毒学与免疫学研究。王秀青等：基因工程抗菌肽表达条件的优化及生物活性试验６３移到含ＺｅｏｃｉｎＴＭ浓度为２５０，５００，７００，１０００／ｍＬ种基因工程抗菌肽对金黄色葡萄球菌μｇ的ＹＰＤＳ平板上，逐级筛选目的基因高拷贝重组菌（ＡＴＣＣ２６００３）和鸡致病性大肠埃希菌（Ｏ１）的最小株。抑菌浓度（ＭＩＣ）。具体操作方法参照文献［３］进行。１．２．１．２重组酵母菌生长密度的测定选取高效１．２．４．２重组抗菌肽的热稳定性表达后