重组bmp4-7融合基因腺相关病毒的构建及其对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

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1、重组BMP4/7融合基因腺相关病毒的构建及其对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响.L.编辑。作者：袁绍辉，尚剑，邵国军，刘玉耆博超刚【摘要】［目的］应用重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体（AAVBMP4/7）转染兔骨髓基质干细胞（BMSCs)，观察其对BMSCs生物学行为的影响。［方法］（1）采用RTPCR一步法和基因重组法，从胎盘组织中克隆BMP4和BMP7成熟肽cDNA，获取BMP4/7融合基因，克隆到质粒pGEM质粒中；（2）从pGEMBMP4/7质粒中切取BMP4/7融合基因克隆到穿梭质粒，在大肠杆菌内重组，在293细胞中构建AAVBM

2、P4/7重组腺相关病毒载体；（3）不同MOI值的AAVBMP4/7转染兔BMSCs，观察细胞形态学变化，MTT法描记细胞生物曲线，观察对细胞增殖的影响，以AAVEDFP做对照；（4）AAVBMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14d后，行ALP及OC含量测定，观察成骨活性，以AAVEDFP做对照。［结果］（1）成功构建高滴度的携带BMP4/7融合基因的重组腺相关病毒AAVBMP4/7；（2）AAVBMP4/7转染BMSCs细胞后，细胞增殖活性良好，转染效率为72%，细胞形态呈典型的成骨改变，1×105vg/cell的MOI值对细胞形态影响较小，而

3、转染效率强于5×104vg/cell(59.38%)。（3）AAVBMP4/7转染细胞后，ALP、OC含量均明显增高，并与转染后诱导培养的时间呈正相关，与对照组比较差异统计学意义（tALP=896.88P<0.001tOC=543.24P<0.01)。［结论］AAVBMP4/7融合基因转染效率高，对BMSCs细胞有明显的诱导成骨活性，对骨愈合的基因治疗提供了新的思路和途径。【关键词】骨组织工程；骨形成蛋白；融合基因；腺相关病毒；骨髓基质干细胞Abstract：［Objective］Todeterminethebiologicaleffect

4、softransfectionofadenoassociatedrirus(AAV)BMP4/7onrabbitbonemarroalcells(BMSCs).［Method］ThematurepeptideofBMP4andBMP7thehumanplacentaandtheBMP4/7fusiongeneid.TheBMP4/7fusiongenenthepGEMBMP4/7andtherebinationultiplicitvofinfection(MOI)values.CellgroeasuredusingMTTmethod.Theossifi

5、cationofcellsorphogeicprotEin;fusiongene;adenoassociatedvirus;bonemarroalcells骨形成蛋白(bonemorphogeicprotEIns，BMPs)具有诱导骨髓基质干细胞(bonemarroalcells，BMSCs)向成骨或成软骨细胞分化、促进新骨形成的作用。BMPs家族已发现20余种成员，以BMP2、BMP4、BMP7的活性最强，它们可促进软骨和新生骨形成。在促进骨及脊柱融合的实验中已取得了成功的经验［1］，其中BMP4，7均表现出不同的促进骨和脊柱融合的作用［2，3］。人体

6、内BMPs多为同源二聚体，也存在少量的异源二聚体，如BMP2／7，BMP4／7等。2.3AAVBMP4／7转染对细胞学形态学的影响以不同的MOI值分别转染兔BMSCs细胞，转染后24h，各组均可观察到细胞形态变化，长梭形细胞收缩，边缘不规则，72h后上述改变明显，部分细胞失去BMSCs典型细胞形态，排列不规则，呈多角形或无规矩形。上述改变随着MOI值地增大而显著，5×104vg／cell基本无明显变化，1×105vg／cell变化较轻，1×106vg／cell组影响最明显，部分细胞崩解(图5)。.L.编辑。图5AAVBMP4／7转染72h后细胞改变5a

7、5×104vg／cell细胞无明显变化5b1×105vg／cell变化明显，长梭形细胞收缩，边缘不规则5c5×105vg／cell细胞进一步变化5d1×106vg／cell部分细胞崩解(×200)2.4AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响转染组和非转染组细胞于接种后12、24、48、72、96h行MTT(λ=630nm)法测定细胞活性，绘制生长曲线，结果表明两组细胞倍数增殖期均出现于24h，转染组活性略低于未转染组，但细胞增殖活跃，提示AAV对细胞生长曲线的影响小(图6a、b)。图6AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响及转染BMSCs细胞的

8、转染效率6aMOI值1×105vg／cell转染6bMOI值5×1