1型重组腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞及对其生物学特性影响的实验研究

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1、博士学位论文学校代码：10023学号：B20100140171型重组腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞及对其生物学特性影响的实验研究所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：血液学研究所曹文彬韩明哲教授冯四洲教授内科学造血干细胞移植基础与临床研究2012年5月中文摘要英文摘要引言目录IIIIIIIIIIIIIIIIY2123719第一部分小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性的研究材料和方法结果讨论24671013第二部分1型腺相关病毒转染小鼠问充质干细胞及对其生物学特性影响材料和方法结果讨论第三部分小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立材料和方法结

2、果讨论结论参考文献综述附录一主要实验仪器和试剂附录二主要溶液配制附录三英文缩略语表附录四在学期间发表文章152430致谢～～⋯～⋯～～～～一～⋯～一⋯一～一61259l26579O345Lo嗣曰中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文1型重组腺相关病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞及对其生物学特性影响的实验研究摘要【目的】l、分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)，确保其良好的增殖能力和多向分化潜能，研究其生物学特征，并对相关生物学特性进行初步研究，为其后应用于动物模型做准备。2、制备rAAVl．EGFP载体。观察其感染染小鼠骨髓问充质干细胞(mMSCs)及对mMSCs生物

3、学特性的影响，并证实该病毒载体可高效转染mMSCs并获得高效稳定的体外表达，以符合体内实验要求【方法】1、冲洗小鼠长骨后，I型胶原酶消化长骨碎片，PBS洗净骨片后完全培养基接种骨片。静置3天，换液去除骨碎片及未贴壁细胞。后每3天换液。细胞融合度达70％一80％胰酶消化，按4×10Vcm2密度接种培养。观察mMSCs生长特点、表面特异性标记、多向分化潜能的变化情况。2、采用PEI转染法将三质粒pTR．EGFP，pXR．1，PXX680共转染293T细胞，包装rAAVl．EGFP，通过氯化铯密度梯度离心纯化获得rAAVl．EGFP；通过实时定量PCR检测病毒滴度。3、采用不同滴度rA

4、AVl．EGFP感染MSCs，需找合适的感染复数。观察转染后mMSCs生长特点、表面特异性标记、多向分化潜能的变化情况。观察rAAVl．EGFP转染对于mMSCs生物学特性的影响。【结果】1、收集小鼠骨片培养，经传代培养3代以上后细胞呈现为均质性较好的短梭形细胞。细胞汇合80％一90％时G0／G1期细胞百分率83。77％。P3．P6代细胞表面抗原高表达CD29、CD44、Sca．1，低表达CD45、CD3l、CD34；P4代细胞经体外定向诱导培养，可分化为成骨及脂肪细胞，证实所培养细胞具备多向分化潜能。2、通过实时定量PCR检测，获得高纯度的滴度为1．4×1011vg／m1的rA

5、AVl．EGFP。3、rAAVl-EGFP感染mMSCs最合适MOI值为105。流式细胞仪检测中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文rAAVl-EGFP感染mMSCs48hGFP．的表达率为97．5％±0．5％。rAAVl．EGFP感染mMSCs后，mMSCs可正常贴壁，生长迅速，形态上无明显改变，其细胞表面特异性标记及多向分化潜能未受明显影响。【结论】l、通过骨片法成功分离、培养了正常C57BL／6小鼠的骨髓间充质干细胞，生物学特性稳定，可用于进行动物实验。2、成功构建了重组腺相关病毒载体，并证实对其对mMSCs具有较高的转染效率并获得高效稳定的体外表达，rAAVl转染

6、未明显影响mMSCS的生物学特性【关键词】小鼠间充质干细胞；重组腺相关病毒；生物学特性Thein-vitrobiologicalcharacteristicsofmurinemesenchymalstemcellsmediatrecombinantadeno-associatedⅥrUSserotypel"ll一‘-l■‘一AbstractboednebyObjective：1、Topurifiedandculturedmurinebonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)withactiveproliferationactivitya

7、ndmultidifferentiationpotential，andstudieditsbiologicalcharacteristicproperties．2、Toproducetherecombinantadeno-associatedvirusserotype1．ToobservethebiologicalcharacteristicsofmousebonemarrowderivedmesenchymalstemcellstransfectedbyrAAV1．EGFP．A