藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用论文

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1、藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用论文刘辉，张筱军，吴强，董兆君【关键词】鱼藤酮；星型胶质细胞；活力；增殖摘要：目的观察鱼藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用的特点。方法体外培养大鼠中脑星型胶质细胞，采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法鉴定。观察染毒星型胶质细胞形态，检测细胞活力，通过生长曲线分析鱼藤酮对星型胶质细胞增殖的影响以及RTPCR检测缝隙连接蛋白(connexin43,CX43)mRNA表达。结果05μmol/L鱼藤酮染毒24h即可引起明显的细胞形态改变；075，10.freelol/L鱼藤

2、酮染毒时星型胶质细胞活力明显降低，乳酸脱氢酶释放量显著增加；05μmol/L以上鱼藤酮可明显抑制胶质细胞增殖，CX43mRNA表达降低。结论鱼藤酮对体外培养星型胶质细胞可以产生明显的毒性损伤作用，但与神经元比较，星型胶质细胞对相同剂量的鱼藤酮染毒具有更强的耐受能力。关键词：鱼藤酮；星型胶质细胞；活力；增殖ToxiceffectsofrotenoneonprimaryculturedastrogliainvitroAbstract：ObjectiveTostudythetoxiceffectsinduced

3、byrotenoneonprimaryculturedastroglia.MethodsRatastrogliaorphologicalobservationRNAorphologyol/Lrotenonefor24hours;theviabilityofcellculturesol/Lrotenone;cellproliferationRNAol/Lrotenone.ConclusionDosedependenttoxiceffectsonprimaryculturedastrogliacouldbei

4、nducedbybeingexposedtorotenone,butastrogliahavehighertolerancetothesamedoseofrotenonepareda公司)；胎牛血清培养基(DMEM/F12)(美国Gibco公司)；类标准胎牛血清(兰州民海生物公司)；Tripure(美国Roche公司)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(美国Amersco公司)。酶标仪(美国BIORAD公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；荧光显微镜E600(日本

5、尼康公司)。12星型胶质细胞原代培养、纯化和鉴定生后3dSD新生大鼠(第三军医大学大坪医院动物所)；断头取中脑组织，按照文献〔4〕方法分离和纯化星型胶质细胞，经3次传代后即可得纯化的星型胶质细胞。星型胶质细胞鉴定采用免疫荧光法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。一抗为兔抗鼠GFAP(1∶100)抗体，二抗为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG(1∶50)，荧火显微镜下，以490nm波长的激发光观察，GFAP阳性细胞即为星型胶质细胞。13染毒星型胶质细胞形态观察将制备的细胞悬液接种于24孔培养板中

6、，用含有20%胎牛血清的培养液培养5d，待细胞基本长满孔壁后，换成含00，01，05和10μmol/L鱼藤酮的培养液。各设2个平行孔，培养24h后，观察鱼藤酮对星型胶质细胞的影响，摄像记录。14MTT法检测星型胶质细胞活力将制备的细胞悬液接种于96孔培养板中，接种密度为50×104/ml。待细胞基本长满孔壁后，换成含00，01，025，05，075，10和20μmol/L鱼藤酮的培养液200μl。每组设6个平行孔，培养24h后每孔加入20μlMTT继续培养4h，然后各孔加入150μl二甲基亚砜溶解紫色结晶

7、，于酶标仪上测定波长490nm的吸光度(A)值，吸光度值的大小反映胶质细胞成活数量及活性。15乳酸脱氢酶(LDH)释放量测定鱼藤酮染毒浓度分别为00，01，025，05，075，10和20μmol/L，星型胶质细胞LDH释放量测定按试剂盒说明书操作。16生长曲线分析鱼藤酮对细胞增殖的影响细胞接种于24孔板中，分别加入含00，01，05和10μmol/L鱼藤酮的培养液1ml，接种密度为50×104/ml，每组设4个平行孔。起始日为当天接种细胞，次日起，即开始检测每孔中的细胞总数，用计数板计数，连续观察5d，

8、取4个孔的平均值绘制生长曲线。17RTPCR检测缝隙连接蛋白CX43mRNA表达PCR引物参照文献〔5〕设计，由上海英骏生物技术公司合成，设磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)阳性产物作为PCR内参照。CX43和GAPDH扩增片段长度分别为291和542bp，引物序列如下：CX43：5′TACCACGCCACCACTGGCCCA3′；5′CATTCTGGTTGTCGTCGGGGAA3′，GAPDH：5′GACCTGACTGACTACC