地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究

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1、地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究作者：金红艳　欧阳铭　戴冀斌【关键词】地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2　　摘要：目的：探讨地塞米松引起体外纯化培养的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡的机制。方法：不同浓度的地塞米松（浓度为10-5、10-4、10-3mol/L）与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵育24小时后，用免疫细胞化学方法检测P53、Bax及Bcl2在星型胶质细胞内的表达情况，表达的强弱用平均光密度表示。结果：P53和Bax的表达随着地塞米松浓度的升高而增强，与对照组比较，各组均有极显著性差异（P<0.01）,Bcl2

2、的表达随着地塞米松浓度的升高先是增强而后减弱，与其他组比较10-3组有显著性差异（P<0.05）。结论：P53和Bax的表达增强可能是大剂量地塞米松引起星型胶质细胞凋亡的主要因素。关键词：地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2　　在哺乳动物的中枢神经系统内约有一千亿个神经元，而在这些神经元的周围又约有十倍以上的胶质细胞存在，其中以星型胶质细胞数量最多。传统观点认为，星型胶质细胞只对神经元起结构和功能上的支持作用，但近年来越来越多的证据表明，星型胶质细胞在中枢神经系统内扮演着更为积极和更为重要的角色，这也是胶质细胞成为神经领域研究热点的一个直接原

3、因。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是一类具有神经活性的甾体激素，已有许多实验证实GC对神经元的生长、分化和凋亡都起重要的调节作用，但对胶质细胞的影响报道不多。已有报道证实大剂量的地塞米松可诱导体外培养的星型胶质细胞凋亡［1］，为进一步探讨其机制，我们做了如下研究。1材料和方法11材料新生EM/F12培养基（GIBCO公司）；胎牛血清和小牛血清（GIBCO公司）；L谷氨酰胺（上海伯奥生物科技有限公司）；地塞米松（湖北恒生制药有限公司）；兔抗p53、Bax、Bcl2抗体（santacruz公司）；SABC免疫组化试剂盒及DAB试剂盒（北京中山公司）；2

4、4孔培养板（Corning公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统（同济千屏影像公司）；SL2300二氧化碳培养箱（美国Sheldon公司）；UFXII光学显微镜（日本Nikon公司）。12方法121星形胶质细胞的纯化培养将出生1~2天的新生EM/F12完全培养基（其中含5%胎牛血清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,链霉素0.1mg/ml）制成细胞悬液。计数后按5×104/cm2接种于培养瓶，加入DMEM/F12完全培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上

5、(240rpm)，摇18小时，去掉含有悬浮细胞的培养液，用DHanks液清洗3次，进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞［2］。经免疫细胞化学方法检测，95%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。122实验分组在24孔培养板的每一孔内放入一张1cm2消毒过的玻片，涂上多聚赖氨酸，然后将星型胶质细胞分组种在玻片上（细胞爬片）。纯化的星形胶质细胞被分成1个对照组和3个实验组，每组3个样本。对照组不加地塞米松，其它3组分别加入终浓度为10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松。在37℃、5%CO2条件下，继续培养24小时,然后作免疫细胞化学分析。123免疫细胞化学染色将各组

6、细胞爬片进行SABC法免疫细胞化学染色。每一培养孔中的细胞爬片经固定、封闭非特异性抗原和消除内源性过氧化物酶等处理后，首先加入特异性抗体（P53、Bax、Bcl2），4℃孵育72h。然后依次加入生物素化羊抗兔IgG，37℃、1h；SABC复合物，37℃、1h；DAB显色5min。每步间均用PBS充分洗涤。所有爬片经脱水、透明、中性树胶封片后，光镜下观察、摄片。以正常兔血清和PBS缓冲液替代一抗作对照染色，结果为阴性。124图像分析用HPIAS1000高清晰图像分析系统进行阳性细胞计数及平均光密度分析。所得数据应用SPSS统计软件，以方差分析进行统计分析，P＜0.05

7、定为差异有显著性,数据以均数±标准差（±s）表示。2结果21形态学观测结果P53对照组：可见少数免疫反应阳性细胞，反应产物呈棕黄色，主要见于胞核（图1）。10-5组：免疫反应阳性细胞增多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆淡染（图2）。10-4组：免疫反应阳性细胞明显增多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆也有表达（图3）。10-3组：大多数细胞呈免疫反应阳性，反应产物呈棕褐色，胞核胞浆界限不清（图4）。Bax对照组：细胞大小形态一致，核膜着色呈棕黄色，胞核中央有透亮区，胞浆淡染（图5）。10-5组：免疫反应产物颜色加深，细胞形态变化不大（图6）。10-4组：颜色进