脂肪酸对肝细胞损伤机制研究——内质网应激及干预

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1、上海交通大学硕士学位论文脂肪酸对肝细胞损伤机制研究——内质网应激及干预姓名：丁佳申请学位级别：硕士专业：内科学（消化系病）指导教师：范竹萍20090430上海交通大学医学院硕士学位论文脂肪酸对肝细胞损伤机制研究——内质网应激及干预摘要背景：胰岛素抵抗（IR）和中央性肥胖是NAFLD的重要发病机制，同时由中央性肥胖、2型糖尿病、胰岛素抵抗、高血压及血脂异常等组成的代谢综合征（metabolicsyndrome，MS）是心血管疾病（CVD）的高危险因素。以往肝脏组织脂肪沉积常常被视为一种良性疾病，但当过多的甘油三醋（TG）水解成游离脂

2、肪酸（FFA）分流到非脂肪组织——肝脏，则可能会引发肝细胞功能障碍及肝脏组织胰岛素抵抗，此即脂毒性在肝脏中的表现。内质网（ER）是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子的储存场所。多种因素如糖类和营养物质的缺乏、病毒感染、脂质代谢异常、钙失衡、自由基及药物等均可引起内质网应激。近年来，大量细胞实验和动物模型表明：肥胖和高脂饮食能诱发肝细胞内质网应激，并同时伴有肝脏和脂肪组织的胰岛素抵抗。因此，研究脂毒性和内质网应激在非酒精性脂肪性肝病发病机制中所起的作用，可对代谢综合征行更深一步的阐述。牛磺熊去氧胆酸作为化学性分子伴侣，能减轻内质

3、网应激，改善遗传性或饮食诱导的肥胖小鼠模型胰岛素的敏感性。本课题将通过建立脂肪变肝细胞模型对脂毒性和内质网应激在NAFLD发病机制中的作用和分子伴侣治疗脂肪变性肝细胞的疗效进行深入探讨。I上海交通大学医学院硕士学位论文第一部分通过建立肝细胞脂肪变模型探讨不同种类脂肪酸对肝细胞的作用目的：通过建立肝细胞脂肪变模型探讨不同种类脂肪酸对肝细胞的作用。方法：将细胞分为三组：对照组、混合脂肪酸组（油酸：软脂酸=2:1）和软脂酸组（油酸：软脂酸=0:3），分别给予不含脂肪酸及含各浓度脂肪酸的RPMI-1640培养液，用CCK-8法测定细胞活力

4、。并以0.5mM和1.0mM的混合脂肪酸与软脂酸分别培养细胞12小时、24小时、48小时，油红O染色观察脂肪酸处理后细胞形态及胞浆内脂滴变化情况。用细胞裂解液裂解细胞后，酶比色法测定细胞内甘油三酯（triglyceride,TG）和胆固醇（totalcholesterol,TC）含量。结果：两种脂肪酸都可诱导肝细胞脂肪变，但单纯软脂酸较混合脂肪酸对正常肝细胞的生长影响更大。且软脂酸0.5mM作用肝细胞24小时即可产生肝细胞脂肪变性、坏死；而混合脂肪酸1.0mM作用肝细胞48小时后，虽然脂肪变性逐渐加重，但细胞未见明显坏死。油红O染

5、色细胞内出现明显的脂质堆积，脂滴数增多；随造模时间延长，混合脂肪酸各组细胞内甘油三酯含量均高于对照组（P<0.05）。结论：油酸软脂酸混合物和单纯软脂酸都能成功建立肝细胞脂肪变模型，并造成肝细胞脂质代谢紊乱。但增加肝细胞内饱和/不饱和脂肪酸的比例即加重脂肪酸对肝细胞的毒性。第二部分不同种类的脂肪酸对肝细胞内质网应激的调控目的：探讨不同种类的脂肪酸对肝细胞内质网应激的调控作用。方法：细胞分组同前。收集细胞，real-timePCR方法检测各组肝细胞内质网应激标志：葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（

6、CHOP）mRNA表达量的变化。结果：混合脂肪酸组（油酸：软脂II上海交通大学医学院硕士学位论文酸=2:1）无论剂量是0.5mM还是1.0mM，或是随着作用时间的延长，GRP78和CHOPmRNA的表达量都未显著增加（P均>0.05）；软脂酸组（油酸：软脂酸=0:3）GRP78和CHOPmRNA的表达量随着作用时间的延长而增加，24h到达高峰后开始下降。相同的脂肪酸浓度前提下，0.5mM时GRP78mRNA表达量在两组脂肪变模型间差异不显著（P=0.870）；而CHOPmRNA表达量差异却十分显著（P<0.001）；1.0mM时软

7、脂酸组GRP78和CHOPmRNA两者的表达量都显著增加（P均<0.001）。结论：饱和脂肪酸（软脂酸）呈时间-剂量依赖性调控肝细胞内质网应激；而不饱和脂肪酸（油酸）对肝细胞内质网应激无显著影响。第三部分分子伴侣对脂肪变性肝细胞内质网应激相关基因表达的影响目的：检测分子伴侣——牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对脂肪变性肝细胞内质网应激相关基因表达的影响。方法：将细胞分为对照组、软脂酸组和干预组，干预组予0.2mM的TUDCA预处理细胞14小时后加入0.5mM和1.0mM的软脂酸培养12或24小时；软脂酸组即予0.5mM和1.0mM的脂

8、肪酸培养12或24小时。以real-timePCR方法检查GRP78和CHOPmRNA表达量的变化。结果：干预组与对照组相比，0.2mMTUDCA对0.5mM软脂酸引起的ERS时GRP78、CHOPmRNA表达量增加无显著影响（P均>0.05）；对