脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性论文

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1、脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性论文唐蕾徐磊韩跃毛洪【摘要】以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果，对革兰阴性菌和酵母无明显作用。【关键词】脱镁叶绿酸；叶绿素酶；高效液相色谱；光敏抗菌活性ABSTRACTPartiallypurifiedchlorophyllethods.Highperformanceliquidchromatographyanalysisshoethod.Theant

2、imicrobialtestshopositivebacteria.KEYicrococcustetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)。均为实验室保藏菌种。1.2培养基及培养条件酵母培养基酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000ml，pH6.0。细菌培养基NaCl5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000ml，pH7.0。121℃灭菌20min。培养

3、温度酵母28℃，细菌37℃，光照为培养箱内置光源。1.3抗菌实验(1)在固体平板上均匀涂布200μl菌液，取10μl待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂培养基表面，光照条件下恒温培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药物(细菌为氨苄西林，酵母为放线菌酮)相比较，每个处理设3个重复。(2)将待测菌在含有50μg/ml的Pheide培养基上十字划线，比较光、暗条件对微生物生长的影响，每个处理设3个重复。1.4叶绿素的提取参照Iriyama法［7］，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和663nm处的吸光值，按照Arno

4、n公式计算叶绿素含量：ChlA(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645ChlB(mg/ml)=0.0229A645-0.00468A6631.5脱镁叶绿酸的制备(1)酶解法采集新鲜的豌豆叶，洗净晾干，在冷丙酮中匀浆后过滤，滤物用冷丙酮漂洗并干燥。1g过滤物用25mL磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0，内含0.24%TritonX100)搅拌抽提4.5h，在8000r/min，4℃条件下离心10min，上清液即为所需叶绿素酶酶液。叶绿素酶酶液中蛋白含量的测定采用双缩脲法。叶绿素酶溶液、20mmol/L磷酸缓冲液和0.15mg/ml叶绿

5、素充分混匀(该反应体系中蛋白质终浓度为3.2μg/μl、丙酮40%、TritonX1000.60%，pH7.0)，在37℃恒温水浴中12h反应完全后，加入正己烷∶丙酮∶10mmol/LKOH(3∶2∶1)涡漩混匀，在8000r/min，4℃的条件下离心10min。取下层并加入几滴盐酸酸化即得到脱镁叶绿酸溶液，4℃冰箱避光保存。(2)酸解法采用Hynninen选择性酸法水解［6］，盐酸乙醚分级分离，将醚层中的溶剂挥发，得到的脱镁叶绿酸溶于丙酮中，4℃冰箱避光保存。1.6高效液相色谱条件色谱柱为Eclipse×DBC18(150mm×3.0mm，5μm)；流

6、动相为95%甲醇溶液(色谱纯)；流速0.8ml/min；检测波长430nm。2结果与讨论2.1脱镁叶绿酸的制备脱镁叶绿酸作为天然卟啉是叶绿素降解的中间产物，在茶叶、柑橘、老化叶中普遍存在，但含量低，分离困难。一般通过叶绿素酶催化，植醇基水解，得到脱植醇叶绿素，继而酸化得到脱镁脱植醇叶绿酸即Pheide(图1)。由于疏水性植醇基的去除，Pheide的亲水性大大增加，可以通过液液分离将底物Chl与产物Pheide分离。由于ChlA和ChlB同时可以作为叶绿素酶的底物，因而产物中除PheideA外还常含有少量的PheideB。Hynninen等［6］根据ChlA、B

7、植醇基水解能力的不同，开发了直接从ChlA、B混合物通过选择性酸降解制备PheideA的方法。图2为菠菜色素的粗提液，经过Iriyama法纯化得到ChlA、B，和选择性酸降解产物的薄层层析结果。得到的产物条带经质谱分析显示分子量为592与PheideA一致。高效液相色谱是检测叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等色素的常用分析手段，本研究用反相高效液相色谱，选择叶绿素和类胡萝卜素的检测波长430nm比较两种制备方法，图谱显示两者的结果相似，其中选择性酸降解的纯度较高(图3)。2.2脱镁叶绿酸抗菌实验我们首先选择实验室保存的5种细菌和6种酵母进行了光敏抑菌实验，结果表明脱

8、镁叶绿酸对革兰阳性菌有明显的抑菌作用，