慢性乙型肝炎患者树突状细胞培养与功能检测方法

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1、慢性乙型肝炎患者树突状细胞培养与功能检测方法【摘要】目的:建立从人外周血分离培养树突状细胞（dendriticcell，DC）及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法。方法:从未接受抗病毒治疗的CHB患者外周血中分离单个核细胞，在含GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养基中诱导培养为DC，流式细胞仪检测细胞表型，混合淋巴细胞反应检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果:CHB患者外周血单核细胞，在体外可诱导出具有典型形态及生物学活性的DC。患者DC的HLA-DR、CD80、CD86的表达率分别为（44.77±8.

2、127）%、(36.65±6.867）%、（32.16±6.340）%，CHB患者DC刺激淋巴细胞增殖的SI为1.39±0.375。与正常人DC相比明显降低（P<0.01）。结论:CHB患者单个核细胞能被诱导培养为DC；通过检测DC表型和刺激淋巴细胞增殖能力可以了解CHB患者抗HBV免疫功能。【关键词】树突状细胞慢性乙型肝炎免疫状态AbstractObjective：ToestablishthemethodofculturingDCfromhumanperipheralbloodandtestingtheph

3、enotypeandthecapacityofstimulatingleukocyte.Methods：SelectingCHBent,PBMCsperipheralblood，andthenculturedinvitroediumcontainingGM-CSFIL-4TNF-αintoDC.ThephenotypeofDCetry.TheabilitiestostimulateTcellproliferateixedleukocytesreaction(MLR).Results:PBMCfromCHBpatie

4、ntsulatingmoleculesCD80、CD86、HLA-DRinthesurfaceofDCsfromCHBpatientsbeforeantiviraltreatmentulationindex(SI)thatDCstimulatelymphocytestoproliferateCHBpatientscouldbeinducedintoDC.TestingthephenotypeandthecapacityofstimulatingleukocyteofDCfromCHBcanbeknomunity.K

5、eymuniticsituation机体特异性免疫反应的产生，是由抗原提呈细胞（APC）捕获抗原，在其对抗原处理后将抗原信息提呈T、B淋巴细胞后引发的。树突状细胞（dendriticcell，DC）是功能最强大的专职的抗原提呈细胞，在机体的免疫反应中起着重要作用［１，２］。HBV持续感染与多方面因素有关，其中患者DC功能低下，抗原提呈能力下降，不能正常诱导机体抗HBV免疫反应是最重要因素之一。HBV持续感染患者仅产生弱的HBV特异的细胞毒性淋巴细胞反应（CTLs），导致HBV病毒不能清除和慢性乙型肝炎的迁延不愈。检

6、测和通过治疗改善患者的DC功能在乙肝免疫治疗中有重要意义。本实验拟建立从人外周血分离培养DC及检测其表型与诱导淋巴细胞增殖能力的方法，并对HBV感染的慢性肝炎患者体内DC功能进行了检测。1材料与方法1.1病例选择选择慢性乙型病毒肝炎10例，男7例，女3例，年龄18岁～50岁，血清丙氨酸转氨酶（ALT）在69U/L～515U/L，平均值为182U/L，6个月内均未使用过抗病毒药物，所有病例参照2005年慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准［３］。7名健康志愿者作为正常对照。1.2主要试剂RPMI1640培养基为GIBCO公

7、司产品。rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a购自晶美公司，为Peprotech公司产品。MTT、丝裂霉素C、HEPES、L-谷氨酰胺为Sigma公司产品。PE荧光标记鼠抗人HLA-DR、CD80、CD86单抗为美国BD公司产品。淋巴细胞分离液（F-K液）为上海荣盛生物试剂厂产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。1.3实验方法1.3.1树突状细胞的体外诱导培养：参照Romani等人分离培养的方法［４］。采集外周血10mL，抗凝后置于无菌试管中，用温热的PBS将抗凝血稀释1倍后，轻轻加在淋巴细胞分离液面上成界面

8、。2000rpm离心20min，收集血清底部与淋巴细胞分离液顶部之间的白膜层，即单核细胞（PBMC）。用预热的约5倍体积的PBS液，分别以1500rpm、1000rpm、1000rpm离心5min洗涤3次，洗尽血小板。用RPMI1640完全培养基悬浮沉淀细胞，吸管吹打混匀，调整细胞浓度为1×106/mL，移入6孔板中。37℃、5%CO2孵箱中孵育2h后，弃去