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1、Wnt3基因在急性髓系白血病中的表达及意义作者：李胜利，徐开林，李振宇，潘秀英，曾令宇【摘要】目的研究L）患者中的表达及其意义。方法应用实时定量PCR（real-timePCR）方法检测10名正常人、40例AML患者中L患者中的表达水平增高，AML缓解后L患者年龄、性别以及初诊白细胞数等临床特征无关；L发病中可能起重要作用，可作为判断AML预后的一个指标。【关键词】急性髓系白血病；L)patients.MethodsExpressionofLpatients.ResultsTheexpressionofLpatients.Thepleteremission(CR)rateinAM
2、LpatientsayplayanimportantroleinAMLpathogenesisandcanserveasanindexinmonitoringAMLprognosis.Keyyeloidleukemia;L）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者以及乳腺癌﹑卵巢癌细胞株中表达增加。本实验采用实时定量PCR（real-timePCR）方法检测L患者中的表达，并分析其意义。1资料和方法1.1研究对象1.1.1实验组2007年6月—2008年6月徐州医学院附属医院血液科住院和门诊AML患者40例（初诊30例，复发10例）。其中M215例，M36例，M48例，M511例。男2
3、0例，女20例，中位年龄36（11～76）岁。10例初诊AML患者随访其缓解前后骨髓，随访中位时间1(0.5～3)个月。所有患者经过骨髓细胞形态学、组织化学染色、免疫表型、分子生物学、细胞遗传学等检查确诊。完全缓解（CR）指临床、血象及骨髓细胞学缓解，未缓解指部分缓解（PR）和未缓解(NR)。1.1.2正常对照组10名，男4名，女6名，中位年龄32（24～48）岁，均为缺铁性贫血患者和造血干细胞移植供者。1.2主要试剂、仪器Trizol抽提试剂盒（BBI公司）、AMV逆转录酶试剂盒（TOYOBA公司）、TaqDNA聚合酶试剂盒（纽英伦生物技术有限公司）、dNTPs(SANGON公
4、司)、DANLadder(MBI公司)、SYBRPremicExTaq试剂盒（TOYOBA公司）、DEPC（AMRESCO公司）、PE-2400PCR基因扩增仪（ABI公司）、Real-time7500荧光定量PCR仪（ABI公司）。NC）的分离无菌条件下抽取骨髓2ml，肝素抗凝，用等体积的Ficoll淋巴细胞分离液，分离出MNC，用1×PBS洗涤2次，取5×107个细胞，-80℃冻存备用。1.3.2总RNA的提取细胞总RNA由Trizol抽提试剂盒提取，按Trizol抽提试剂盒说明书进行，所提总RNA经分光光度计测定光密度（D），D260/D280值在1.8～2.0者用于rea
5、l-timePCR检测。1.3.3cDNA第一链的合成20μl反应体系包括：5×RTBuffer4μl,2.5mmol/LdNDP2μl,Oligo(dT)181μl,RNASimple3μl,AMV逆转录酶2μl，补无核酶水至20μl。反应条件为30℃10min,42℃60min,99℃5min灭活逆转录酶。cDNA于-20℃保存。1.3.4制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板选择表达mol/LdNTP2.5μl,10×PCR缓冲液2.5μl,TaqDNA聚合酶1U,上下游引物各1μl,cDNA1μl,加水至总体积25μl。采用的循环参数为:95℃预变性5min,35个PC
6、R循环（94℃，30s；退火温度，20s；72℃，30s）,72℃延伸5min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物为单一特异性扩增条带；同样的方法获得GAPDH的扩增条带（图1）。将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为108，分别稀释为1×108、1×107、1×106、1×105这几个梯度浓度的DNA。1.3.5进行real-timePCR反应50μlreal-timePCR反应体系包括:SYBRPremixExTaq25μl,上下游引物各1μl,cDNA或DNA1μl,补水至总体积为50μl。GAPDH：95℃，10s；40个PCR循环
7、（95℃，3s；60℃，20s；72℃，36s）；溶解曲线（95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s）。ePCR反应。根据绘制的浓度梯度稀释DNA标准曲线，对各样品的目的基因和管家基因进行定量。每个样品的ePCR实验结果半定量比值以±s表示、阳性率以百分比（%）表示，两均数进行t检验,多组均数进行单因素方差分析,两配对均数进行配对t检验，率的比较进行χ2检验，P＜0.05为差异有显著性。2结果2.1L患者中的表达10例正常人检测到较低水平L临床特征的关系AML患者不同年龄
