中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制

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1、中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制作者：徐军，刘学民，马清涌，潘承恩【关键词】急性病ExperimentalstudyonPMNinacuteseverepancreatitisorphonuclearneutrophils(PMN)frombronchoalveolarlavagefluidinacuteseverepancreatitis(ASP)andtodiscusstherelatedmechanism.METHODS:FortyEightmaleSDratsodelepoint.Atscheduledtime,bronchoalveolarl

2、avagefluidethod.TheratioofapoptosisandnecrosisofPMNetryandLDHaseabilityeasured.RESULTS:InASPgroup,thesurvivalratioofPMNincreasedandapoptosisofPMNeabilityalsoincreased.CONCLUSION:ThedelayofPMNapoptosisleadstopersistentactivationandleakageoftoxiccontentsofPMN,acia公司产品，AnnexinvFITC凋亡检测试剂盒(

3、AnnexinvFITCApoptosisDetectionKit)系Sigma公司产品.采用Hitachi7170全自动生化分析仪，美国BD公司流式细胞仪FACS.calibur，Hitachi600型透射电镜.　　1.2方法　　将大鼠于实验前12h禁食，自由饮水，采用100g/L氯氨酮80mg/kgip麻醉，随机分为实验组及对照组，每组各24只.常规消毒，腹正中切口进入腹腔.实验组分别于十二指肠及肝门端用小动脉夹暂时夹闭阻断胰胆管.近肝门端用4号头皮针穿刺胰胆管，1min内匀速注入35g/L牛磺胆酸钠1mL/kg,压迫注射点，5min后去除动脉夹，逐层关闭腹腔，完

4、成ASP模型制作.对照组仅翻动十二指肠.实验及对照组大鼠均每8只为一时间点，分别于术后3,6,12h剖杀.解剖分离肺，由主气管插入塑料管，注入10mLPBS液，反复灌洗3次，回收液体，回收率约80％左右.灌洗液经离心后，分别留取上清及细胞沉淀.将细胞沉淀用PBS液重新悬浮，用密度梯度离心Percoll液（密度分别为1.085和1.095）行密度梯度离心（700g4℃30min），吸取PMN富集层并进一步洗脱纯化，将所获PMN稀释至1mL备用.肺泡灌洗液及血液乳酸脱氢酶（LDH）检测应用全自动生化分析仪检测.用光镜及电镜观察肺组织的病理变化.取肺泡灌洗上清液，测定白蛋白

5、及总蛋白含量，计算白蛋白/总蛋白比值.　　1.2.1PMN凋亡/坏死细胞定量取上述PMN悬浮液，加500μL细胞悬液于试管中,加入5μL用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的AnnexinV和10μL的碘化丙啶(PI)，室温下避光放置10min，采用膜联蛋白VFLUOS和碘化丙啶双标法，用流式细胞仪双通道检测5000个细胞，激发波长488nm，发射波长515,610nm.膜联蛋白Ｖ阳性为凋亡早期细胞，PI阳性为坏死细胞，膜联蛋白V，PI双阳性为凋亡晚期/坏死细胞.　　1.2.2肺髓过氧化物酶活性测定取肺组织加邻联茴香胺制成肺组织匀浆.冻融并超声粉碎，离心后取上清加反应液，

6、在分光光度计460nm波长下进行2min扫描，记录第30s和第90s的吸光度差值，以此值代表PMN的（MPO）酶活力的改变.　　统计学分析：数据以x±s表示，2组各项参数均采用方差分析进行比较.P<0.05表示差异有统计学意义.　　2结果　　2.1LDH含量对照组大鼠肺灌洗液中可检测到少量的LDH,但较血中明显减少.实验组各时段肺灌洗液中LDH显著增加,与对照组有显著性差异(P<0.01)，但各时间点的LDH差异不明显.对照组大鼠血中可检测到少量的LDH，实验组各时段血中LDH显著增加,与对照组有显著性差异(P<0.01),但各时间点间无明显差异(T

7、ab1).表1ASP各时段MPO活性及血清LDH活性（略）　　2.2肺通透指数和PMN凋亡实验组各时段肺通透指数均明显升高，与对照组比较有显著性差异（Tab2）.对照组大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡处于相对较高水平，各时间段无显著差异.实验组大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡明显减少，与对照组存在显著差异(P<0.01,Tab2).表2肺泡灌洗液中PMN凋亡比率、LDH活性及肺通透指数（略）　　2.3肺组织MPO活性实验组各时段与对照组相比，肺MPO活性均明显升高，且各时段内相互比较，肺MPO活性随时间呈增加的趋势，在12h段达到峰值(P<0.0