胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系

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1、胃癌组织及区域淋巴结微转移与胃癌生物学标志基因的临床关系作者：翟瑜李勇苏力范立侨脱红芳郭贵军【摘要】目的从分子水平上，探讨细胞角蛋白(CK6、CK18)联合检测在胃癌淋巴结微转移中的诊断价值和临床意义。方法应用RTPCR方法，以CK6、CK18为标志基因，检测正常胃黏膜60例，原发胃癌组织60例，胃癌组无转移淋巴结(PNo)180枚，比较其表达差异以及与临床病理参数之间的关系。结果①60例正常胃黏膜中几乎无CK6、CK18的表达；②原发胃癌组织和其相应的淋巴结转移灶中CK6、CK18的表达相一致；③CK6在淋巴结转移灶

2、中的表达水平低于原发癌中的表达水平，而CK18则相反；④CK6阳性多在三期以上的肿瘤；⑨在原发肿瘤以及淋巴结转移灶中，CK6、CK18的表达与患者的性别、年龄无明显统计学差异。结论用RTPCR法检测胃癌无转移淋巴结CK6、CK18mRNA是发现胃癌淋巴结微转移敏感而特异的方法，对胃癌临床分期及指导治疗有较大的临床意义。【关键词】胃癌;微转移;细胞角蛋白;RTPCR胃癌的微转移是指恶性肿瘤在发展过程中，肿瘤细胞播散并存活于血液循环、淋巴道、骨髓及组织器官中，而未形成转移结节，其特点是无任何临床表现，且常规检查方法，如影

3、像、病理等均难以发现〔1〕，是胃癌根治术后复发及胃癌患者治疗失败和生存率低的原因之一〔2，3〕。因微转移灶多数小于2mm，所以通过传统组织学检查癌旁淋巴结并不能诊断出全部微转移〔4，5〕，不过随着现代分子生物学技术的发展和新的肿瘤标志物的发现，微转移的检测方法也在不断的更新。本文即应用反转录聚合酶链反应（RTPCR）技术检测胃癌无转移淋巴结（PN0）中细胞角蛋白6（CK6）及细胞角蛋白18（CK18）的表达，对于临床上指导治疗，预测复发，评价预后提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1研究对象标本均取自2007年6月～

4、2007年8月河北医科大学第四医院普外科行胃癌手术切除的病例，共60例，其中男38例，女22例。年龄52～72〔平均（61.2±8.4）〕岁。每个病例取肿瘤中心部位的癌组织及远离癌组织5cm以上的正常胃黏膜，以及淋巴结8～15枚（平均10枚）。每枚淋巴结一半送病理，一半保存，从中选取病理检查结果为阴性的淋巴结3枚。离体标本手术切除后立即置于液氮中，后转移至-80℃低温冰箱中保存。　　1.2引物设计引物由南京斯迈特公司合成。CK6、CK18引物的序列设计，见表1。　　表1引物序列、产物大小及GenBank号（略）　　1.3

5、总RNA抽提及鉴定60例胃癌组织，180枚淋巴结和60例正常组织中分别加入提取试剂(Invitrogen)1ml，电动匀浆1～2min，匀浆液室温放置5min后加氯仿200μl，振荡15s，12000r/min4℃离心15min；上层水相移至另一Eppendorf管，加异丙醇500μl，混匀室温放置10min，12000r/min4℃离心15min；弃掉上清加1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500r/min4℃离心5min；弃掉上清，空气干燥RNA沉淀10min；用适量焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的水溶解PNA。2%

6、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量。测定RNA纯度、浓度及完整性。以总RNA为模板，经逆转录得到cDNA。　　1.4RTPCRRTPCR总反应体系25μl。用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作内参照，将PCRMix混匀后进行扩增。CK6预变性94℃5min；PCR扩增（35个循环）94℃30s，60℃30s，72℃30s；延伸72℃7min。CK18预变性94℃5min；PCR扩增（35个循环）94℃30s，72℃1min；延伸72℃7min。GAPDH预变性94℃5min；PCR扩增（30个循环）94℃30s，55℃3

7、0s，72℃30s；延伸72℃7min。上、下游引物见表1，反应体系见表2。　　1.5结果观察PCR产物在加溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶图像分析系统上观察结果并拍照。作为内参引物的GAPDH片段长度为230bp，CK6、CK18基因扩增片段分别为164和154bp。若在相应位置出现DNA条带，则CK6或CK18mRNA表达阳性，淋巴结存在微转移〔6〕。　　表2聚合酶链反应体系（略）　　1.6统计学处理采用χ2检验，以实验数据的95%可信区间为正常值范围。数据处理通过统计软件SPSS10.0完成。　　2结果　

8、　2.1各组CK6和CK18阳性表达比较60例正常胃黏膜中无CK6、CK18的表达；胃癌组织中CK6的阳性率为21.7%（13/60），CK18的阳性率为63.3%（38/60），CK18显著高于CK6的表达;常规病理学检查未发现转移的180枚淋巴结(PN0)中，经RTPCR方法检测，发现有22枚淋巴结CK6mRN