不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析

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1、不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析游元元万德光裴瑾杨文宇【摘要】目的研究四川地区主流桑树品种桑叶的HPLC指纹图谱，并进行聚类分析，探讨品种对桑叶化学成分累积的影响。方法建立桑叶的HPLC指纹图谱，对16批样品共有峰峰面积进行聚类。结果不同品种桑叶相似度均大于0.90，但所含化学成分的含量存在差异，相同基原不同品种的桑叶被聚类到了不同类别中。结论桑叶中化学成分的累积与品种有一定相关性。【关键词】桑叶品种高效液相指纹图谱聚类分析中国栽桑养蚕有上千年的历史，每年秋蚕饲养完毕后，桑树所余叶片即可作为桑叶药材被收购使用，所以桑叶的药用是附属于养蚕业的。四川是蚕桑大省，随着蚕桑业的发展，近年

2、来四川地区培育了众多桑树品种，又从外地引进了不少品种推广种植，故巿售的桑叶药材实际来源于多个品种的桑属植物。尽管大多数桑的栽培品种均源于桑科植物桑MorusalbaL.，桑叶来源符合《中国药典》规定〔1〕，但不同品种的桑叶之间必然存在质量差异。本研究选取了目前在四川全省推广栽培的多个主流桑树品种，采用高效液相色谱指纹图谱技术，比较了不同品种冬桑叶的指纹图谱，并进行了聚类分析，以期为探讨品种对桑叶化学成分累积的影响奠定基础，为四川地区桑叶药材的质量评价提供参考。1仪器与材料1.1仪器DionexP680型高效液相色谱仪(美国戴安公司)，由P680泵、UVD170U紫外检测器、TCC-10

3、0柱温箱、ASI-100自动进样器及Chromeleon色谱工作站组成。BP1215电子天平（德国赛多利斯公司，d＝0.1mg），Rios纯水器（密理博上海贸易有限公司），AS5150BD-I超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。1.2试药甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯（AR）；芦丁对照品（批号10080-200306）与绿原酸对照品（批号110753-200413）购自中国药品生物制品检定所。1.3材料桑叶对照药材（批号121123-200302）购自中国药品生物制品检定所，其它样品于20071113从四川省农业科学院蚕业研究所桑树种质

4、资源圃采集。样品资料见表1。表1桑叶样品品种1.4数据处理软件采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（国家药典委员会）进行HPLC图谱的数据分析；应用SPSS13.0版进行聚类分析。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为PhenomenexLunaC18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇（A）-0.5％磷酸（B）梯度洗脱，甲醇的体积变化：0～10min为14.5%，10～20min为14.5%→25.5%，20～28min为25.5%→32%，28～40min为32%→38.5%，40～55min为38.5%→49%；流速1.0ml·min-1；检测波长32

5、0nm；柱温30℃；进样量15μl。2.2溶液制备2.2.1对照品溶液制备精密称取对照品绿原酸5.10mg、芦丁0.85mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.2供试品溶液制备取样品粉末（过4号筛）1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50ml，称重，浸泡过夜，超声提取45min，称重，补足减失重量。过滤，精密量取续滤液25ml，减压浓缩至近干，残渣用70%甲醇溶解并定容至5ml，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.3方法学考察2.3.1精密度实验取供试品溶液（桐乡青），按已建立的HPLC分析条件连续进样5次，考察主要色谱

6、峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于1%。仪器精密度良好。2.3.2重复性实验取同一供试品（新一之濑）5份，按供试品溶液的制备和检测方法进行制备并检测，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于3%，指纹图谱的全貌无明显变化，符合指纹图谱要求。2.3.3稳定性实验取同一供试品溶液（桐乡青），分别在0，2，4，8，12，24，48h等不同时间点进样分析，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于3%，表明样品在48h内是稳定的。2.4不同品种桑叶的HPLC指纹图谱获取将16个桑叶样品按照所建立的方法进行分析，所得色谱图导入《中药色谱指

7、纹图谱相似度评价系统2004A版》。以中检所购得的对照药材作为指定参照图谱，经色谱峰匹配，采用中位数法生成对照图谱，通过“相似度计算”功能进行色谱图谱样本与对照图谱的相似度评价。匹配数据显示，所有样品HPLC图谱共有15个共有峰(见图1与图2)。通过与对照品比较，样品中的4号峰与12号峰分别被鉴定为绿原酸与芦丁。在各样品图谱中，4号峰绿原酸的峰面积最大，保留时间适中，且与相邻色谱峰分离良好，故将其指定为内参照峰。16批样品相似度为0.915～0