不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析论文

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1、不同品种桑叶高效液相指纹图谱的聚类分析论文.freeleleon色谱工作站组成。BP1215电子天平（德国赛多利斯公司，d＝0.1mg），Rios纯水器（密理博上海贸易有限公司），AS5150BD-I超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。1.2试药甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯（AR）；芦丁对照品（批号10080-200306）与绿原酸对照品（批号110753-200413）购自中国药品生物制品检定所。1.3材料桑叶对照药材（批号121123-2003

2、02）购自中国药品生物制品检定所，其它样品于20071113从四川省农业科学院蚕业研究所桑树种质资源圃采集。样品资料见表1。表1桑叶样品品种1.4数据处理软件采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（国家药典委员会）进行HPLC图谱的数据分析；应用SPSS13.0版进行聚类分析。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为PhenomenexLunaC18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇（A）-0.5％磷酸（B）梯度洗脱，甲醇的体积变化：0～10min为14.5%，10

3、～20min为14.5%→25.5%，20～28min为25.5%→32%，28～40min为32%→38.5%，40～55min为38.5%→49%；流速1.0ml·min-1；检测波长320nm；柱温30℃；进样量15μl。2.2溶液制备2.2.1对照品溶液制备精密称取对照品绿原酸5.10mg、芦丁0.85mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2.2供试品溶液制备取样品粉末（过4号筛）1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50ml，称重，浸泡过夜，超

4、声提取45min，称重，补足减失重量。过滤，精密量取续滤液25ml，减压浓缩至近干，残渣用70%甲醇溶解并定容至5ml，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.3方法学考察2.3.1精密度实验取供试品溶液（桐乡青），按已建立的HPLC分析条件连续进样5次，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于1%。仪器精密度良好。2.3.2重复性实验取同一供试品（新一之濑）5份，按供试品溶液的制备和检测方法进行制备并检测，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其

5、RSD均小于3%，指纹图谱的全貌无明显变化，符合指纹图谱要求。2.3.3稳定性实验取同一供试品溶液（桐乡青），分别在0，2，4，8，12，24，48h等不同时间点进样分析，考察主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，其RSD均小于3%，表明样品在48h内是稳定的。2.4不同品种桑叶的HPLC指纹图谱获取将16个桑叶样品按照所建立的方法进行分析，所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》。以中检所购得的对照药材作为指定参照图谱，经色谱峰匹配，采用中位数法生成对照图谱，通过“相

6、似度计算”功能进行色谱图谱样本与对照图谱的相似度评价。匹配数据显示，所有样品HPLC图谱共有15个共有峰(见图1与图2)。通过与对照品比较，样品中的4号峰与12号峰分别被鉴定为绿原酸与芦丁。在各样品图谱中，4号峰绿原酸的峰面积最大，保留时间适中，且与相邻色谱峰分离良好，故将其指定为内参照峰。16批样品相似度为0.915～0.995，相互吻合程度较高，说明样品所含化学成分及相对含量比较一致，但共有峰的总峰面积比（样品共有峰总峰面积/所有批次样品共有峰总峰面积的平均值）显示，不同品种所含化学成分的绝

7、对含量存在差异见图3。2.5不同品种桑叶的HPLC指纹图谱的聚类分析将16个桑叶样品的15个共有峰峰面积作为特征，采用离差平方和法(orusalbaLinn.，S12基原为Morusalbavar.multicaulis，S5、S6、S10为杂交桑。第3类中S13基原为Morusalbavar.multicaulis，S4、S7、S8、S11为杂交桑。第4类中S9、S15基原均为Morusalbavar.multicaulis。为更好地满足蚕桑业发展需要，人们不断地改良桑树品种。在繁育栽培过程中

8、，种质、嫁接方式、树龄等因素都会影响桑叶中化学成分的累积，使同地生长同时采收的相同基原的桑叶被聚类到了不同类别中。15个四川地区主流桑树品种中，以湘7920的桑叶所含化学成分总量最多，总峰面积比为1.56；此外嘉陵20号桑叶化学成分总量也较多，总峰面积比为1.14。这两个品种在四川各地良桑推广中占有绝对优势，故四川地区收购的桑叶药材中有相当一部分来自这两个品种，其品质优良。【