鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱

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1、鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱【关键词】鲜无蹼壁虎指纹图谱高效液相色谱法聚类分析　　Abstract：ObjectiveToestablishanHPLCfingerprintoffreshGekko,andtodiscussthesimilarityamongGekkos.MethodsTheretentiontimeandabsorptionintensityofextractsofGekkoinedbyHPLC,peakareaofsixkindsofGekkosamples’mutualpeakseandabsorp

2、tionintensityatographiccondition,theHPLCfingerprinticalconstituentsofdifferentGekkoarerelatedtothekinds.　　Keym×250mm，5μm粒度。流动相：A，亚沸水；B，乙腈。梯度洗脱：0～5min，100%A，流速0.7ml/min；5～6min流速由0.7ml/min升至1ml/min；6～16min，0～10%B；16～21min，10～40%B；21～31min，40～60%B；31～46min，60～100%B；4

3、6～60min，100%B。进样量10μl；检测波长205nm；室温。　　2.2供试品的制备购买秋季捕捉的活壁虎，随机选取14～15只（约50g），在容器内放置72h，以消化、排空壁虎体内的食物，蒸馏水清洗晾干后准确称重，置入95％酒精致死，用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000/min），50ml95％酒精分两次涮洗捣碎机，合并涮洗液以浸泡匀浆后的壁虎，不时摇动，浸泡24h后抽滤；滤渣用50ml95％酒精再次浸泡提取，抽滤；合并两次的提取液，定容于100ml；置-2℃冰箱内保存；使用时，取一定量的样品液经0.45μm微孔滤膜

4、过滤；当其温度转变为室温后，以10μl进样分析。潍坊干壁虎的处理：将捕捉到的潍坊活壁虎按常规方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml95％酒精浸泡1d（软化），用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000r·min-1），用原酒精液继续浸泡2d，提取，抽滤；滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，以10μl进样分析。　　2.3方法学考察　　2.3.1检测波长的确定由于业界对壁虎所含的有效药物成分尚无系统的研究和分析，其有效药物成分组成和结构尚不得而知，为了使壁虎乙醇提取液中所含有的物质能在紫外光检测波长下被最大限度地检出，宜选择短波长进行

5、检测。在选用205，210，215，220nm进行色谱分析后，对比所得色谱图发现：除色谱吸收的强度随波长增大而依次降低外，吸收峰的数量多寡无明显改变，据此而确定205nm为色谱参数，用于色谱检测。　　2.3.2流动相及柱温的确定实验表明使用空调控制室温，在22～26℃的温度条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的保留时间、峰高、峰面积数据的RSD均小于1.2%，在室温条件下的测试结果是可靠的。经采用不同的流动相梯度洗脱，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法开始的最初5min以0

6、.7ml/min的流速进行洗脱可使保留时间较短（3～8min）的物质得到较好的分离，满足测试的需要。　　2.3.3稳定性考察取鲜无蹼壁虎的乙醇溶液测试品分别在0，6，12，24，36，48h不同时间进行测试，考察色谱峰保留时间与吸收强度的一致性，如图1中所标示的各指纹峰的保留时间与吸收强度的RSD均小于1.1%。　　2.3.4仪器精密度实验在空调的设定温度为24℃时，取测试品连续五次进样，图1中各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的RSD均小于0.6%。　　2.3.5重复性实验取壁虎分4次制作供试品，分别进样。结果显示各指纹峰

7、的保留时间、峰高及峰面积的RSD均小于1.6%。　　2.4色谱图中选作指纹峰的保留时间区间范围的确定　　2.4.1壁虎95％酒精提取液的后续处理采用潍坊壁虎作抗肿瘤药用效果研究，匀浆后的壁虎用95％酒精连续浸泡提取5次，抽滤后，合并5次提取的抽滤液，在30℃下减压蒸馏浓缩，除去其中的乙醇，获得带黄色固体沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍体积的蒸馏水后，水液经正己烷和二氯甲烷分别各萃取4次，得黄色水溶液。水溶液在30℃下减压蒸馏浓缩，冻干，得棕色浸膏状物。浸膏状物用95％酒精溶解，作硅胶柱层析，得各层析后样品。　　2.4.3确定

8、指纹峰的保留时间区间范围通过上述各水溶性样品进行相同色谱条件下的色谱分析，发现各色谱图中的吸收峰的保留时间均在20min以内，考虑到抗肿瘤有效成分是水溶性的（谢爽、王学美的研究也有同样的结论［6，7］），故将保留时间在20min以内作为选取指纹峰的时间界限。　　2.5聚类分析为进行各种壁虎所含抗肿瘤成分