骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

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1、骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究【摘要】目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)，观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC，绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化，鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC，由门静脉注入肝移植受体，取肝组织冰冻切片，观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC，并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d，可在体外传代20代以上，具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测

2、符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100%。荧光显微镜观察，可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高，生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。【关键词】分离培养;鉴定;大鼠;肝移植骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是一种成体干细胞，具有高度的增殖能力和多向分化潜能。国内外学者将MSC应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，取得了显著

3、的效果。MSC具有免疫原性低、自体或异体植入无明显排斥反应、体外转基因效率高的特点，是基因工程的良好载体。笔者对MSC进行分离培养及表型鉴定，并观察其在同种异体肝移植受体内的定居情况。　　1材料与方法　　1.1动物和试剂3～4周龄雄性SD大鼠，体质量80～100g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号为SCXK(沪)20070005]。胎牛血清(美国Hyclone公司)，LDMEM培养基(美国Gibco公司)，CD34FITC抗体、CD90FITC抗体、CD44PE抗体、CD45

4、PE抗体、CD11bPE抗体(英国AbD公司)，DAPI试剂(美国Sigma公司)。　　1.2MSC的分离培养及传代大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡10min，取股骨及胫骨，用加有肝素的LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞。1000r/min离心10min，用含10%胎牛血清的LDMEM混匀，以2×105cm-2密度进行接种，培养于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的培养箱内。2d后全量更换培养液，去除未贴壁的细胞。每2～3d换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征。原代细胞80

5、%～90%融合时，0.25%胰酶进行消化约2～3min，1∶2比例进行传代。　　1.3MSC生长曲线绘制取第3代细胞，以1×104mL-1细胞悬液分别接种于24孔培养板中培养，每孔1mL。每日取出3孔，连续7d，消化后细胞计数，绘制生长曲线。　　1.4流式细胞仪检测MSC表面标志取第3代MSC，接近90%融合时，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，1000r/min离心5min，取1×106细胞悬于100mLPBS中。分别加入CD34、CD44、CD45、CD90、CD11b抗体至饱和浓度，室温避光反应30m

6、in，PBS洗涤，以FCMBuffer固定细胞，流式细胞仪进行检测。　　1.5体外诱导MSC成骨、成脂肪分化取第3代MSC，每孔1×105接种到六孔板，24h后加入诱导介质。成骨诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、10mmol/Lβ磷酸甘油、100nmol/L地塞米松和0.2mmol/L抗坏血酸。成脂诱导介质为LDMEM，含10%胎牛血清、1μmol/L地塞米松、5μg/mL胰岛素、0.5mmol/L1甲基3异丁基黄嘌呤(IBMX)和60μmol/L吲哚美辛。每周换液2次。诱导两周后分别用

7、茜素红和油红O溶液染色来检测骨细胞中的矿物质沉淀和脂肪组织中的中性脂肪滴。　　1.6MSC在移植肝内定居能力的观察(1)DAPI荧光标记MSC：第3代MSC生长到80%融合后，更换培养液，将荧光染色剂DAPI加入培养的MSC上清中，终浓度为50mg/L，孵育30min，PBS洗去未结合的DAPI，荧光显微镜下观察。(2)大鼠原位肝移植模型建立：按　　Pittenger等认为MSC必须具有的特征是：体外培养时呈成纤维样集落形成单位，并贴壁生长，能够自我更新，分化为3种以上间质细胞系[3]。对细胞周期的研究表明

8、，大多数细胞处于G0/G1期，表明MSC具有强大的分化增殖能力[10]。目前MSC尚无明确的特异性表面标志。MSC稳定高表达的表面抗原标志包括SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD54、CD58、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124，而对其他造血细胞表面标志如CD11、CD14、CD34、CD45则不表达[3，1012]。笔者所培养的MSC，CD44、CD90高表达，CD34、CD