血管平滑肌细胞快速牵张损伤后细胞缝隙连接功能的变化

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1、血管平滑肌细胞快速牵张损伤后细胞缝隙连接功能的变化作者：徐锡金，霍霞，李燕，MargaretA［摘要］目的：探讨牵张损伤时血管平滑肌细胞(A7r5)缝隙连接功能的改变及其影响因素。方法：采用细胞牵张损伤装置建立A7r5细胞损伤模型，通过细胞培养、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜荧光漂白后恢复技术检测对照组，轻度、中度和重度牵张损伤组细胞活性(Hoechst33342和propidiumiodide染色)、细胞内钙(Fluo_4/AM染色)、细胞内氧自由基(H2DCFDA染色)和细胞间通讯功能(5_CFDA染色)的变化。结果：随着细胞牵张损伤的

2、加重，细胞活性降低、细胞内钙及细胞内氧自由基升高、细胞间通讯功能下调。含钙缓冲液和细胞间通道阻断剂甘珀酸可使细胞通讯功能进一步下调，而Ca2＋鳌合剂――乙二醇四乙酸、氧自由基清除剂――超氧化物歧化酶可使细胞通讯功能上调。结论：牵张损伤可通过细胞内钙超载和活性氧的增多来降低平滑肌细胞缝隙连接的细胞通讯功能。　　［关键词］平滑肌细胞(A7r5)；细胞损伤；缝隙连接　　Abstract］Objective:Toestimatetheroleandaffectedmechanismofgapjunctionsduringcellinjury.Meth

3、ods:A7r5cellsandprovidedtheabilitytodeformandinjurethecells.Mild,moderateandseveregroupsofrapidstretchinjury(RSI,55,65,75mmdeformation)odel94Acellinjurycontroller.Cellinjuryiodide(PI).Gapjunctionmunicationeasuredusingconfocallaserscanningmicroscopy(CLSM).FRAPagedunderCLSMus

4、ingthefluorescentdyesfluo_4AMandH2DCFDA/AM,respectively.Results:RSIproducedleveldependentincreasedinPI_positivecells,［Ca2＋］iandROS,butdecreasedingapjunctionalmunication.DPBSandgapjunctionblockerCarbenoxalonecouldfurtherdecreasegapjunctionmunication;chelatorEGTAcouldincrease

5、gapjunctionmunication.Conclusion:Theseresultssuggestthatincreasesin［Ca2＋］iandROScontributetocellinjuryandimpairedgapjunctionalmunicationafterRSIinA7r5cellsinvitro.　　［KeyEM(Cellgro公司，美国)和体积分数10%胎牛血清(Gibco公司，美国)，并常规加入青霉素(100ku/L)和链霉素(100mg/L)，在37℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养至细胞处于单层融合状态。

6、　　12细胞牵张损伤模型的建立　　根据　　23细胞内钙和ROS水平随牵张损伤程度加重而升高　　随着细胞牵张损伤的加重，［Ca2＋］i和ROS水平均升高(图6，7)。经含钙DPBS处理后各组［Ca2＋］i水平均高于经无钙DPBS处理的细胞，其中各损伤组的升高更为明显，与对照组比差异有统计学意义(P<001)，说明细胞损伤后细胞外钙内流增加，损伤组细胞ROS水平较对照组升高(P<001)。　　3讨论　　在中枢神经系统创伤研究中，由于体外研究模型能排除体内损伤过程中各种复杂因素的作用，并能区分原发损伤和继发损伤的细胞以及观察单因素对某种

7、细胞的影响，故近年来体外培养细胞损伤模型日益引起人们的重视［8～10］。根据生物力学研究得到的颅脑创伤发生时的力学参数发展起来的细胞牵张损伤装置可近似地模拟在体脑创伤过程中细胞受压、牵张变形的应力变化［11,12］。此模型的优点是致伤条件易控制，重复性好，可控制损伤程度等。这种精确的控制有利于比较细胞对生理或损伤变形的反应，为研究颅脑损伤的病理机制和药物作用提供一个有用手段。　　以往有关细胞牵张损伤模型的研究多集中于神经细胞和神经胶质细胞［3,4,8～12］，而对血管平滑肌细胞在牵张损伤时的生理、病理和功能变化未见报道。A7r5细胞是胚胎鼠主

8、动脉的平滑肌细胞［13］，细胞培养易存活，分裂增殖迅速，易于贴壁，牵张损伤后细胞不脱落，损伤后的细胞有修复和再生能力，是研究体外创伤较理想的细胞。本实验以A7r5细