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1、观察人皮肤成纤维细胞经动态培养增殖达到平台期后不同保存条件下细胞的活力-->摘 要:目的 观察人皮肤成纤维细胞经动态培养增殖达到平台期后不同保存条件下细胞的活力。方法 以微载体cyto-dex-3为载体,接种成纤维细胞,用改良培养基进行动态培养,以静态培养为对照,检测两种方法培养的细胞在常温和4℃保存条件下的活力和保存时间。结果 成纤维细胞在微载体动态培养中具有正常的形态,能快速大规模扩增,在室温条件下能保存较长的时间并具有较高的活力。结论 动态培养的成纤维细胞扩增迅速良好,且保存方法简单又能维持较高的活力,保存时间较长,
2、具有静态培养不可比拟的优越性,对组织工程皮肤种子细胞的运输、保存具有较高实用价值。关键词:成纤维细胞;微载体;动态培养 近年来,随着人口老龄化速度加快,慢性皮肤溃疡患者日益增多,加之烧伤和意外创伤引起的皮肤缺损,使得临床上移植皮肤的需求量越来越大,组织工程皮肤是目前治疗皮肤缺损性疾病最有希望的方法之一[1]。成纤维细胞是真皮中最主要的细胞,也是构建组织工程皮肤的重要种子细胞。人皮肤成纤维细胞(humandermalfibroblasts,HDF)经微载体规模化培养扩增后能否方便地保存,其活力情况如何,还缺乏研究。因此本实
3、验采用磁力搅拌微载体细胞培养技术,比较4℃和室温条件下细胞活力的变化,来探讨保存条件对细胞活力和保存期限的影响,为细胞微载体培养后的保存提供依据。1 材料与方法1.1 标本 第三军医大学大坪医院美容门诊正常儿童包皮环切术包皮(经患者家属及本人知情同意)。1.2 主要试剂与仪器 DMEM培养基干粉(美国Gibco公司)、0.25%分离酶(美国Sigma公司)、0.2%胶原酶(美国Roche公司)、0.25%胰蛋白酶(Amrecsco公司分装)、2%二甲基二氯硅烷四氯化碳溶液(上海生工)、四氯化碳(重庆化学试剂公司)、Cyto
4、dex-3(美国Sigma公司)、二甲基亚砜(美国Merck公司)、电子磁力搅拌器(美国ScientificIndustries公司)、搅拌培养瓶(美国BellcoGlass公司)、CKX41SF2倒置相差显微镜(日本Olympus)、CASY-TT细胞计数仪(德国CASY公司)、紫外光分光光度计DU-600(美国Beckman)等。1.3 方法1.3.1 成纤维细胞的分离、培养和传代 将所取标本按本研究建立的方法分离出成纤维细胞[2],弃上清,加DMEM培养液制成细胞混悬液,接种至T25培养瓶中,于37℃、5%CO2、9
5、5%空气、100%湿度的孵箱中培养。24h后更换培养基,以后更换培养液每3天换1次,大约5~7d左右长满后按1:3传代。1.3.2 微载体和培养瓶处理 称取0.5g微载体(cytodex-3)于50mL离心管中用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后浸泡过夜(14~16h),吸弃PBS,用含10%胎牛血清的DMEM(10%FCS-DMEM)浸泡过夜(14~16h)后高压灭菌备用。动态培养瓶按所购厂家的使用说明硅化后灭菌处理备用。1.3.3 微载体动态培养 本实验用第6~10代细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,将细胞总量(接种浓度为
6、4×107/L)8×106接种于容量为500mL的搅拌培养瓶中,培养瓶预先加入10%FCS-DMEM培养基200mL(本研究部分改良)以及0.5g微载体(cytodex-3),吸附2h,按每20分钟搅拌10min(10~15r/min)的条件使细胞悬浮于培养基中,以利于更好地贴附于微载体上。2h后培养模式改变为20r/min,连续搅拌50min,暂停5min,循环进行。搅拌培养基每3天换1次液,每次换液时需注意先静置搅拌瓶5~10min,待培养基澄清后用长吸管吸弃上清液,每次更换原培养基的4/5。采用相同细胞密度(4×10
7、7/L)即4×104/mL,按每瓶接种5mL细胞悬液,共接种于30个T25培养瓶作静态对比。1.4 观测指标1.4.1 细胞形态和增殖的观察 每隔24h观察静态和动态培养的HDF在倒置相差显微镜下细胞形态的变化,并用CASY细胞计数仪检测活细胞数和活细胞比例,微载体混悬液取5mL,T25取1瓶消化后均配成5mL细胞悬液取3次样,测定3次。连续观察12d依据所得数据绘制细胞生长曲线。1.4.2 4℃和常温保存条件下细胞活力的比较 在微载体动态培养HDF的第11天时各取混悬液100mL,静置10min后更换DMEM培养基(未经
8、改良),调节HEPES至25mM,分别存放于4℃和室温条件,保存期间不换液,从第1天起隔日各取均匀混悬液4mL,测1次/mL,共12个时相点,采用MTT法测定其活力,方法是:将混悬液静置5min,弃上清,PBS洗1次,加入1mLMTT(5mg/mL),37℃、5%CO2的培养箱中孵育45min后取出,1
