不同温度保存的山羊皮肤成纤维细胞的培养

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1、2013年11月第6期(总第163期)草食家畜(双月刊)不同温度保存的山羊皮肤成纤维细胞的培养詹俐楠，张志崇，张秋婷，王春生，朴善花，安铁洙(东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040)摘要：为了丰富获取山羊成纤维细胞的途径．本研究将采集到的幼山羊耳廓皮肤组织在4cc和20℃下保存一段时间后，进行原代和传代培养其成纤维细胞，并将传代培养的成纤维细胞经冷冻一复苏后进行继代培养。其结果显示，与对照组f新鲜皮肤)成纤维细胞在原代培养时的贴壁需要2d和达到8O％汇合需要8d相比，皮肤在20℃下保存12h和24h后，其成纤维细胞的原代培养贴壁时间(3-6d

2、)和80％汇合时间(12～14d)有所延迟；而皮肤在4℃下保存24h和48h后，其成纤维细胞的贴壁所需要时间为3d，达到80％汇合所需要时间为10d；与对照组传代培养达到80％汇合所需要的时间(3d)相比，源于在20℃和4℃下保存的皮肤原代成纤维细胞，经传代培养后，其继1代和继2代成纤维细胞可在第3d或4d达到约80％汇合；与对照组传代培养的成纤维细胞经冷冻一复苏后进行继代培养时．达到80％汇合所需要的时间(4d)相比，源于在2O℃和4oC下保存的皮肤传代培养成纤维细胞，无论保存时间长短，均可在开始培养后第4或第5d达到约80％汇合。上述结果表明，山羊死

3、亡后在4—20cI=下即使保存l～2d．仍能利用其皮肤获得与源于新鲜皮肤的成纤维细胞相似的正常的成纤维细胞关键词：山羊：皮肤；成纤维细胞；细胞培养中图分类号：：$814．8文献标识码：A文章编号：1003—6377(2013)06—0045—04大量的研究证实，动物皮肤成纤维细胞是最易分离培养的体细胞之一。目前，常以动物成纤维细胞为核供体、或者经转染外源基因的转基因成纤维细胞为核供体，通过体细胞核移植的方法生产克隆动物或转基因动物。此外，成纤维细胞还常用于诱导多能性干细胞(Inducedpluripotentstemcell，iPS)~3J。为了丰富获取

4、山羊成纤维细胞的途径，本研究将采取的幼山羊耳廓组织在4℃和20℃保存一段时间后．采用常规方法进行原代和传代培养其成纤维细胞，并进行冷冻保存，以探讨利用在不同温度下保存的山羊皮肤获得成纤维细胞的方法。该研究为获取死亡后一段时间的珍贵山羊皮肤成纤维细胞提供了依据。1材料与方法1．1皮肤的采集及其保存选择3日龄的萨能奶山羊幼羊，利用耳廓打孑L钳采取直径约为0．5cm耳廓边缘皮肤f以下称为皮肤1块。将皮肤块用PBS清洗3次后。导入含有约4mLPBS的10mL冷冻管中并加盖封口。将含有皮肤块的冷冻管，在4℃条件下分别保存0h、24h、48h和72h的同时，在20℃

5、分别保存0、12、20、24h。1．2成纤维细胞的原代培养将在4℃下保存0h、24h、48h和72h及在2O下保存0、12、20、24h的皮肤块，用mPBS清洗3次并剪成约为lmm的小块。以含10％胎牛血清的DMEM液为培养液，采用常规方法利用皮肤小块进行成纤维细胞的原代培养。开始培养后，每隔24h在倒置荧光显微镜下观察细胞的贴壁和细胞达到约80％汇合的情况，并在细胞贴壁后，每隔24h更换约50％的新鲜培养液。1．3成纤维细胞的传代培养收稿日期：2013—09—07基金项目：国家自然科学基因项目(31272441，31000990)作者简介：詹俐楠(19

6、89一)，女，硕士研究生。主要研究方向：转基因动物生产。通讯作者：安铁洙(1958一)，男，教授，博士生导师。主要研究方向：动物胚胎工程。452013年11月第6期(总第163期)草食家畜(双月刊)将上述原代培养的成纤维细胞，在其达到约8o％~E合时，采用常规方法进行传代培养f起始细胞浓度为lxlO个／mL)。开始进行传代培养后，每隔24h，观察细胞达到约80％汇合的情况．并在细胞贴壁后更换约5O％的新鲜培养液。1．4成纤维细胞的冷冻、复苏及继传代培养将上述经原代培养达到约80％汇合的成纤维细胞，以DMSO冷冻保护剂，采用常规法[41对成纤维细胞进行冷冻

7、保存。将冷冻保存的成纤维细胞，经复苏后，采用上述的传代培养方法进行传代培养。开始培养后，每隔24h，观察细胞达到约80％汇合的情况，并在细胞贴壁后更换约50％的新鲜培养液。2结果2．1山羊皮肤的保存温度和时间对原代培养成纤维细胞的影响当新鲜的山羊皮肤成纤维细胞在原代培养的第2d和第8d时，分别出现贴壁和达到80％汇合。与其相比，当保存温度为20℃时，随着保存时间的延长，其成纤维细胞的贴壁时间(保存l2、20和24h时的贴壁时间分别为3、5和6d)和约8o％fE合时间(保存12、20和24h时的80％汇合时间分别为12、13和l4d)均有所延长；当在保存温

8、度为4℃下，保存24h和48h后，其成纤维细胞的贴壁所需要时间为3d．达到8O％