益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用

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1、益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用作者：周泉,王拥军,施杞,孙鹏,周重建,胡志俊,刘梅【关键词】,益气化瘀方［摘要］目的：研究益气化瘀方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘纤维环细胞bcl2、Bax及半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）表达的影响。方法：用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清，以及胰岛素样生长因子1（insulinlikegroulasonapoptosisrelatedfactorsofanulusfibrosuscellsinrats　　ABSTRACTObjec

2、tive:TostudytheeffectsofYiqiHuayuRecipeanditsdeposedformulasmedicatedseraonexpressionsofbcl2,Baxandcaspase8ofapoptoticanulusfibrosuscellsinrats.Methods:Immunohistochemicalandintegralopticaldensityanalyticmethodsedicatedseraandinsulinlikegroulascandelaydegenerationofthecervicalin

3、tervertebraldisc,aybeduetoitsactioninregulatingtheexpressionsofbcl2,Baxandcaspase8.　　KEYedium,DMEM），Gibco公司产品；粗品胶原酶，上海市医药工业研究院产品；胰蛋白酶，Promega公司产品；小牛血清，杭州四季青生物制剂公司产品；鼠抗人bcl2蛋白单克隆抗体，兔抗人Bax蛋白单克隆抗体，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物试剂盒，Dako公司产品；兔抗人caspase8蛋白单克隆抗体，SantaCruz公司产品；CO2培养箱，HeraeusB5060EKCO

4、2；CSB1超净台，上海净化设备厂产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；120目尼龙网筛过滤器、培养瓶，Unclon公司产品；CMIAS99B型医学图像系统，北京航空航天大学图像中心产品；益气化瘀方（黄芪、党参、川芎、丹参，人工麝香），益气方（黄芪、党参），化瘀方（川芎、丹参，人工麝香）［1］。　　1.2细胞培养及分组1月龄大鼠，无菌手术条件下，取下颈部椎间盘纤维环，采用连续酶消化法分离、培养［2］。细胞生长铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代，将Ⅲ代细胞以2×104/ml密度接种于内置玻片的6孔培养板和培养瓶内，培养第5天时，换无血清培养液

5、孵育，24h后去上清液，加入含1%小牛血清DMEM配制的抗Fas抗体，浓度为0.25μg/ml，继续培养12h后，分为6组：正常对照组、凋亡诱导组、中药血清治疗组（益气化瘀方、益气方和化瘀方）［1］、重组人IGF1（R＆DSystemsInc产品，用1％小牛血清配制成终浓度为50ng/ml）组，再孵育48h，然后收集细胞进行观察。　　1.3Bax、bcl2和caspase8细胞免疫化学法检测取纤维环细胞玻片，磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3min，3次；85%、95%和

6、100%乙醇脱水，用中性树脂将盖玻片无细胞面贴在载玻片上，自然风干；0.3%H2O2室温20min，PBS洗涤3min，3次；0.1%Triton×100PBS洗20min，PBS洗涤3min，3次；加入一抗；4℃冰箱过夜，PBS洗涤3min，3次；加入二抗为生物素化羊抗兔IgG（1∶400），37℃，30min,PBS洗涤3min，3次；抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）HRP(1∶400)，37℃，40min，PBS洗涤3min，3次；0.05%联苯二胺加0.03%H2O2，12min；苏木素衬染，常规封片。阳性结果判断：染色阳性表达为

7、棕黄色，无着色为阴性。以不加一抗为阴性对照。　　1.4图像分析取免疫组化染色玻片，200倍光学显微镜下，在上下的基础上，再分左、中、右，共观察6个视野，使用CMIAS99B型医学图像系统，用积分光密度对阳性信号进行量化分析。　　1.5统计学方法用SPSS10.0统计软件包，进行单因素方差分析。　　2结果　　正常对照组的Bax和caspase8积分光密度低，轻度表达；凋亡诱导组的Bax和caspase8积分光密度高，表达明显，高于正常对照组(P<0.01)；正常对照组的bcl2积分光密度高，bcl2高度表达；凋亡诱导组的bcl2积分光密度低，表达不

8、明显，与正常组比较有统计学意义(P<0.01)。3种中药药理血清及IGF1组和凋亡诱导组