益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用

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1、益气化瘀方及其拆方对大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡相关因子的作用作者：周泉，王拥军，施杞，孙鹏，周重建，胡志俊，刘梅【关键词】，益气化瘀方［摘要］目的：研宄益气化瘀方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘纤维环细胞bcl2,Bax及半胱氨酸蛋白酶8(caspase8)表达的影响。方法：用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析益气化瘀方及其拆方益气方、化瘀方药理血清，以及胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactorl，IGFI)对抗Fas抗体(antiFasantibody)诱导凋亡大鼠椎间盘纤维环细胞bcl2、Bax及ca

2、spase8表达的影响。结果：益气化瘀方、益气，方、化瘀方及IGF1血清处理组与凋亡模型组相比，bcl2表达升高，Bax及caspase8表达降低，均有统计学意义(P［关键词］益气化疲方:椎间盘:纤维环细胞;bcl2;Bax;caspase8EffectsofYiqiHuayuRecipeanditsdecomposedformulasonapoptosisrelatedfactorsofanulusfibrosuscellsinratsABSTRACTObjective:TostudytheeffectsofYiqiHuayuRecipe

3、anditsdecomposedformulasmedicatedseraonexpressionsofbcl2,Baxandcaspase8ofapoptoticanulusfibrosuscellsinrats.Methods:Immunohistochemicalandintegraloptica.ldensityanalyticmethodswereusedtoobservetheeffectsofYiqiHuayuRecipe,YiqiRecipe，HuayuRecipemedicatedseraandinsulinlikegro

4、wthfactorl(IGFl)ontheexpressionsofbcl2,Baxandcaspase8ofapoptoticanulusfibrosuscellsinratsinducedbyantiFasantibody.Results:Ascomparedwithapoptosisgroup，bcl2expressionwashigher,Baxandcaspase8expressionswerelowerinYiqiHuayutreated,Yiqitreated，HuayutreatedandIGFIgroups(PKEYWOR

5、DSYiqiHuayuRecipe:intervertebraldisc:anulusfibrosus;bcl2:Bax;caspase8椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞的凋亡和细胞外基质合成与分泌的减少，椎间盘细胞自分泌和旁分泌Fas配体触发凋亡。益气化瘀法是施杞教授根据大量临床和实验研究总结出来的治疗颈椎病的法则，本研宄探讨其对椎间盘细胞凋亡相关因子的作用。1材料与方法主要试剂、仪器与材料达氏修正依氏培养基(Dulbecco'smodifiedEagle’sMedium,DMEM)，Gibco公司产品;粗品胶原酶，上海市医药工业研究院产品

6、；胰蛋白酶，Promega公司产品;小牛血清，杭州四季青生物制剂公司产品；鼠抗人bcl2蛋白单克隆抗体，兔抗人Bax蛋白单克隆抗体，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物试剂盒，Dako公司产品；兔抗人caspase8蛋白单克隆抗体，SantaCruz公司产品；CO2培养箱，HeraeusB5060EKC02；CSB1超净台，上海净化设备厂产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；120目尼龙网筛过滤器、培养瓶，Undon公司产品；CMIAS99B型医学图像系统，北京航空航天大学像中心产品；益气化瘀方（黄芪、党参、川芎、丹参，人工麝香），益气方（

7、黄芪、党参），化瘀方（川芎、丹参，人工麝香）［1］。细胞培养及分组1月龄大鼠，无菌手术条件下，取下颈部椎间盘纤维环，采用连续酶消化法分离、培养［2］。细胞生长铺满瓶底后，用％胰蛋白酶消化，传代，将III代细胞以2X104/ml密度接种于内置玻片的6孔培养板和培养瓶内，培养第5天时，换无血清培养液孵育，24h后去上清液，加入含1%小牛血清DMEM配制的抗Fas抗体，浓度为ug/ml,继续培养12h后，分为6组：正常对照组、凋亡诱导组、中药血清治疗组（益气化瘀方、益气方和化瘀方）［1］、重组人IGF1（R&DSystemslnc产品，用1%小牛

8、血清配制成终浓度为50ng/ml）组，再孵育48h，然后收集细胞进行观察。Bax、bcl2和caspase8细胞免疫化学法检测取纤维环细胞玻片，磷酸盐缓冲液(phosphateb