γ―分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞notch信号通路相关蛋白表达的影响

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1、γ―分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响[摘要]目的探讨γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对体外培养糖尿病（DM）大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）Notch信号通路相关蛋白表达的影响。方法体外培养DM大鼠VSMCs，随机分为两组：正常培养基组（con组）、加入不同浓度（0.15、2.50、7.50μmol/L）DAPT的培养基组（实验组），72h后收集细胞，分别用双向电泳方法和大鼠VSMCs后，使其Notch信号通路相关蛋白表达减少，在一定浓度范围内（1.

2、25～7.50μmol/L）呈浓度依赖性。中国6/vie　　[关键词]Notch信号通路；γ-分泌酶抑制剂；血管平滑肌细胞；双向电泳　　[中图分类号]R587.1[文献标识码]A[]1673-7210（2017）02（c）-0024-04　　糖尿病足（DF）是糖尿病（DM）的慢性并发症之一，是高血糖、周围血管病变、周围神经病变等多种因素共同所致，病因复杂，致残、致死率高，治疗费用高。目前针对DF及微血管病变的治疗效果难以令人满意。Notch信号通路具有促进非DM动物缺血区血管新生、动静脉分化等作用

3、。本课题通过γ-分泌酶抑制剂（DAPT）干预体外培养的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs），研究对Notch信号通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表达的影响。　　1材料与方法　　1.1实验材料　　冻存的DM大鼠VSMCs（SPF级SD大鼠购自大连医科大学动物实验中心，质量合格证号：0003546，经DM大鼠模型建立、取材后冻存）[1]。　　1.2主要试剂和仪器　　DAPT（美国Sellect公司）；全自动凝胶电泳图像分析系统（日本Oly

4、mpus公司）；Mini-Protean3电泳系统、MiniTrans-Blot转移系统（北航图像中心）；蛋白浓度测定试剂、β-actin（美国Sigma公司）；兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Notch3单克隆抗体、兔抗Notch4单克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）�慰寺】固濉⒉质罂勾笫�Jagged-2蛋白（JAG2）单克隆抗体、仓鼠抗大鼠DLL4蛋白单克隆抗体（美国SantaCruz公司）；Bio-Lyte载体两性电解质、IEF电泳槽、IPG预制胶条（美国BioRad公司

5、）。　　1.3细胞培养　　取冻存的DM大鼠VSMCs进行细胞复苏，将其接种于96孔板，D-Hank′s液冲洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02%EDTA・4Na约3mL进行消化，制成单细胞悬液。按1∶2传代培养，传至3代后，随机分为两组：正常培养基（con）组和加入DAPT的培养基（实验）组（浓度梯度分别为0.15、1.25、7.50μmol/L），继续培养传至6代。　　1.4方法　　1.4.1蛋白提取取配置好的单细胞悬液，加入预冷的细胞裂解液400mL，冰浴静置40min，提取蛋白。　

6、　1.4.2双向电泳检测目标蛋白在198mm×256mm×1mmSDS凝胶上，标记纵横坐标，将目的蛋白加入坐标原点，进行第一向等电聚焦电泳，聚焦结束后的胶条经平衡处理后立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，拍照，应用计算机软件分析处理。取提取的蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。煮沸，变性，标记，上样检测或于-80℃保存。　　1.4.3大鼠VSMCs蛋白双向电泳检测结果显示，在凝胶上可以看到800多个蛋白点，其中大多数蛋白位于pH5.0～8.5，分子量为134～3

7、00kD。应用计算机软件Image-Master2DPlatinumsoftware分析，其中“十字”表示计算机探测到的凝胶分离出的蛋白质点，“标签”表示经过计算机软件自动编号后的目标蛋白点，说明提取的蛋白质中含有实验所需目的蛋白。见图1。