资源描述:
《γ―分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞notch信号通路相关蛋白表达的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、γ―分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响关键字:分泌,酶抑制,酶抑制剂,抑制,抑制剂,制剂,体外,体外培养,培养,糖尿,糖尿病,大鼠,血管,血管平滑肌,管平,平滑,平滑肌,肌细胞,细胞,notch,信号,信号通路,通路,相关,蛋白,白表,表达,影响γ―分泌酶抑制剂对体外培养的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响本文为Word文档,感谢你的关注! [摘要]目的探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对体外培养糖尿病(DM)大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Notch信号通路相
2、关蛋白表达的影响。方法体外培养DM大鼠VSMCs,随机分为两组:正常培养基组(con组)、加入不同浓度(0.15、2.50、7.50μmol/L)DAPT的培养基组(实验组),72h后收集细胞,分别用双向电泳方法和Westernblot法检测Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的表达。结果①双向电泳图谱证实提取的蛋白中含有目的蛋白。②Westernblot检测结果显示:随DAPT浓度的增加,Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白的
3、表达均递减;7.50μmol/L组与对con组比较,差异有高度统计学意义(P0.05)。结论DAPT作用于体外培养的DM大鼠VSMCs后,使其Notch信号通路相关蛋白表达减少,在一定浓度范围内(1.25~7.50μmol/L)呈浓度依赖性。 [关键词]Notch信号通路;γ-分泌酶抑制剂;血管平滑肌细胞;双向电泳 []R587.1[]A[]1673-7210(2017)02(c)-0024-04 糖尿病足(DF)是糖尿病(DM)的慢性并发症之一,是高血糖、周围血管病变、周围神经病变等多种因素共同所致,病因复杂,致残、致死率高,治
4、疗费用高。目前针对DF及微血管病变的治疗效果难以令人满意。Notch信号通路具有促进非DM动物缺血区血管新生、动静脉分化等作用。本课题通过γ-分泌酶抑制剂(DAPT)干预体外培养的DM大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs),研究对Notch信号通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表达的影响。 1材料与方法 1.1实验材料 冻存的DM大鼠VSMCs(SPF级SD大鼠购自大连医科大学动物实验中心,质量合格证号:0003546,经DM大鼠模型建立、取材后冻存)[1]。 1.2主要试
5、剂和仪器 DAPT(美国Sellect公司);全自动凝胶电泳图像分析系统(日本Olympus公司);Mini-Protean3电泳系统、MiniTrans-Blot转移系统(北航图像中心);蛋白浓度测定试剂、β-actin(美国Sigma公司);兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Notch3单克隆抗体、兔抗Notch4单克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-1蛋白(JAG1)�慰寺】固濉⒉质罂勾笫�Jagged-2蛋白(JAG2)单克隆抗体、仓鼠抗大鼠DLL4蛋白单克隆抗体(美国SantaCruz公司);Bio-Lyte载体两性电解质、IE
6、F电泳槽、IPG预制胶条(美国BioRad公司)。 1.3细胞培养 取冻存的DM大鼠VSMCs进行细胞复苏,将其接种于96孔板,D-Hank′s液冲洗2遍,加入0.25%TRYPSIN+0.02%EDTA・4Na约3mL进行消化,制成单细胞悬液。按1∶2传代培养,传至3代后,随机分为两组:正常培养基(con)组和加入DAPT的培养基(实验)组(浓度梯度分别为0.15、1.25、7.50μmol/L),继续培养传至6代。 1.4方法 1.4.1蛋白提取取配置好的单细胞悬液,加入预冷的细胞裂解液400mL,冰浴静置40min,提取蛋
7、白。 1.4.2双向电泳检测目标蛋白在198mm×256mm×1mmSDS凝胶上,标记纵横坐标,将目的蛋白加入坐标原点,进行第一向等电聚焦电泳,聚焦结束后的胶条经平衡处理后立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后,取出凝胶,拍照,应用计算机软件分析处理。取提取的蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,计算上样量。煮沸,变性,标记,上样检测或于-80℃保存。 1.4.3Westernblot检测蛋白表达情况取30μg蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、
8、Jagged-2、DLL4单克隆抗体(1∶200),4℃孵育过夜,加入二抗IgG(1∶5000稀释),室温孵育1h,ECL试剂盒显影,以β-actin为内参进行数据标准化,以对照组为参照样本,计算Notch