人dna修复基因hogg1真核表达载体的构建及序列测定论文

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1、人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定论文魏永长，南克俊，惠凌云，贺大林【关键词】遗传载体；HOGG1基因；克隆,分子；DNA修复ConstructionandsequencingofeukaryoticexpressionvectorofhumanDNAbaseexcisionrepairgeneHOGG1【Abstract】AIM:ToclonehumanDNAbaseexcisionrepairgene,8oxoguanineDNAglycosylase(HOGG1),andconstructitseuk

2、aryoticexpressionvectorthelivertissueofhumanfoetusbytheguanidiniumthiocyanatemethod.TheplifiedbyRTPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpCMVMyc.PlasmidDNAeanalysis.ClonesrepresentingcDNAinsertsoleculor;DNArepair【摘要】目的：克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体，进行序列测定.方法：提取人胎肝总RNA，设计H

3、OGG1特异性引物，通过RTPCR扩增，将HOGG1基因克隆到pCMVMyc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证.结果：获得人HOGG1基因全长.freele公司)；pCMVMyc载体试剂盒(Cloech公司)；RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶（Promega公司）；Taq酶、DH5α感受态细菌、凝胶回收试验盒、所有寡核苷酸和引物及克隆测序均由上海申能博彩公司提供.其他试剂为通用高纯试剂.DNA扩增采用PE9600扩增仪.1.2方法1.2.1RTPCR扩增HOGG1基因取来自于意外流产的100mg人胎肝组织,在液氮中研磨至粉

4、末状，加入1mLTrizol，按产品提供的操作手册抽提总RNA.紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度，使A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之间.变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下观察并拍照.在2mg总RNA中，加入DEPCH2O，使总体积为8mL，加入0.5mLRNA酶抑制剂、2mLoligo(dT)引物、400UMMLVRT逆转录合成cDNA第一链，逆转录反应为37℃1h，90℃5min，冰上冷却，室温高速离心5s.将cDNA溶液储存于-20℃备用.参考GenBank登录的HOGG1基因的cDNA序列(NM_0168

5、20.2)设计扩增HOGG1全长的引物.上游引物序列为F(EcoRI)：5′AGAGAATTCGGATGCCTGCCCGCGCGCTTCTG3′，上游引物从起始密码子ATG开始.R(KpnI)下游引物序列为：5′TTTCTGGTACCGATAAAACCATCCTTAGCG3′，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA.分别在上游引物5′，下游引物3′端引入EcoRI和KpnI的酶切位点，目的是为了克隆到真核表达载体pCMVMyc对应的位点中.预期扩增产物长度为1233bp.PCR反应体系50μL：25mmol/L的PCR特异

6、引物各1μL，Taq聚合酶0.5μL，dNTP混合液0.5μL，cDNA2μL.扩增条件：94℃变性5min,94℃30s,55℃40s，72℃40s，35个循环后，72℃延伸10min.PCR扩增产物用12g/L琼脂糖电泳，胶回收试剂盒回收目的条带.1.2.2HOGG1基因真核表达载体的构建及鉴定PCR扩增产物用EcoRI和KpnI双酶切2h，凝胶回收试剂盒回收DNA，该片段与同样双酶切回收后的pCMVMyc载体连接，转化宿主E.coliDH5a感受态细胞（氯化钙法），挑取单克隆白色菌落筛选重组质粒.重组克隆用克隆PCR方法

7、鉴定，鉴定引物为载体测序引物CMVF和扩增HOGG1的下游引物，扩增条件同上,扩增产物大小正确的克隆，用含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养，用质粒制备试剂盒制备质粒，阳性用于序列测定.2结果2.2.1HOGG1基因扩增成功地扩增出全长的HOGG1基因.图1为RTPCR的扩增产物，电泳可见1200bp左右的扩增条带，与预计的大小基本吻合.2.2.2构建HOGG1基因真核表达载体通过RTPCR扩增HOGG1获得PCR产物，经过胶回收酶切产物，回收直接克隆到pCMVmyc载体对应的位点，转化大肠杆菌.通过菌落PCR方法，初步筛

8、选出重组克隆（图2）.随机挑选出5个克隆，其中一克隆（泳道1），与其他4个克隆（泳道25）相比,插入片段偏小,没有做进一步分析.泳道2～5共4个克隆插入大小一致，经过测序分析，结果表明这4个克隆的插入片段为HOGG1基因.通过序列分析和比较部分克隆的序列与预计的不同，泳道5对