人dna修复基因hogg1真核表达载体的构建及序列测定

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1、人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定　　【Abstract】　AIM:ToclonehumanDNAbaseexcisionrepairgene,8oxoguanineDNAglycosylase(HOGG1),andconstructitseukaryoticexpressionvectorthelivertissueofhumanfoetusbytheguanidiniumthiocyanatemethod.TheplifiedbyRTPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpCMVMyc.Plasmid

2、DNAeanalysis.ClonesrepresentingcDNAinsertsoleculor;DNArepair　　【摘要】目的：克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体，进行序列测定.方法：提取人胎肝总RNA，设计HOGG1特异性引物，通过RTPCR扩增，将HOGG1基因克隆到pCMVMyc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证.结果：获得人HOGG1基因全长，并成功构建pCMVMyc/HOGG1真核表达载体.结论：HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向治疗药物的开发提供一种新的手段.　　【关键词】　遗传载体；HOGG1基因；克隆，分子；DNA修

3、复　　0引言　　细胞的有氧代谢过程及其暴露于环境诱变剂时均可产生活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)［1-2］.在患病情况下,生物的抗氧化能力有一定限度,一旦生物体内的氧化应激负荷超过抗氧化系统所承载的极限,ROS便可攻击DNA造成DNA损伤.损伤的DNA在再次复制和分裂时可形成突变.DNA突变可激活癌基因或使抑癌基因失活,从而导致细胞生长周期紊乱.DNA氧化损伤产生大量的修饰碱基,其中8羟基鸟嘌呤（8oxoG）能高度致突变性损伤.鉴于此，研究者把它用作肿瘤发生过程中氧化损伤的敏感标志物［3］.HOGG1基因编码的hOgg1蛋白具有DNA修复功能

4、,参与8oxoG的切除,从而保护遗传物质不受损伤［4］.我们采用基因工程的方法,从人胎肝组织中克隆人HOGG1基因，并构建其真核表达载体，以进一步研究该基因在肿瘤DNA氧化损伤修复中的作用.　　1材料和方法　　1.1材料Trizol(invitrogen公司)；限制性内切酶EcoRI/KpnI(SibEnzyme公司)；pCMVMyc载体试剂盒(Cloech公司)；RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶（Promega公司）；Taq酶、DH5α感受态细菌、凝胶回收试验盒、所有寡核苷酸和引物及克隆测序均由上海申能博彩公司提供.其他试剂为通用高纯试剂.DNA扩增采用PE9600扩

5、增仪.　　1.2方法　　1.2.1RTPCR扩增HOGG1基因取来自于意外流产的100mg人胎肝组织,在液氮中研磨至粉末状，加入1mLTrizol，按产品提供的操作手册抽提总RNA.紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度，使A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之间.变性琼脂糖凝胶电泳,紫外透射光下观察并拍照.在2mg总RNA中，加入DEPCH2O，使总体积为8mL，加入0.5mLRNA酶抑制剂、2mLoligo(dT)引物、400UMMLVRT逆转录合成cDNA第一链，逆转录反应为37℃1h，90℃5min，冰上冷却，室温高速离心5s.将cDNA溶液储存于-20℃

6、备用.参考GenBank登录的HOGG1基因的cDNA序列(NM_016820.2)设计扩增HOGG1全长的引物.上游引物序列为F(EcoRI)：5′AGAGAATTCGGATGCCTGCCCGCGCGCTTCTG3′，上游引物从起始密码子ATG开始.R(KpnI)下游引物序列为：5′TTTCTGGTACCGATAAAACCATCCTTAGCG3′，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA.分别在上游引物5′，下游引物3′端引入EcoRI和KpnI的酶切位点，目的是为了克隆到真核表达载体pCMVMyc对应的位点中.预期扩增产物长度为1233bp.PCR反应体系50μL

7、：25mmol/L的PCR特异引物各1μL，Taq聚合酶0.5μL，dNTP混合液0.5μL，cDNA2μL.扩增条件：94℃变性5min,94℃30s,55℃40s，72℃40s，35个循环后，72℃延伸10min.PCR扩增产物用12g/L琼脂糖电泳，胶回收试剂盒回收目的条带.　　1.2.2HOGG1基因真核表达载体的构建及鉴定PCR扩增产物用EcoRI和KpnI双酶切2h，凝胶回收试剂盒回收DNA，该片段与同样双酶切回收后的pCMVMyc载体连接，转化宿主E.coliDH5a感受态细胞（氯化钙法），挑取单克隆白色菌落筛选重组质粒.重