trail与ddp联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞增殖作用的影响

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1、TRAIL与DDP联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞增殖作用的影响作者：毕林涛高长斌卢振霞宿晓云【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖的可能机制。方法以重组载体pACCMVTRAIL转染人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，VTRAIL表达载体分别进行处理，观察不同药物处理组细胞中凋亡相关蛋白表达的变化，以确定TRAIL与化疗药物顺铂是否具有协同作用，并探讨其可能机制，为白血病的治疗提供新的策略和理论依据。　　1材料与方

2、法　　1.1实验材料RPMI1640培养基，胎牛血清购自Gibco公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；鼠抗人TRAIL、survivin、caspase3、核因子(NF)κB单克隆抗体购自美国Santa公司；PVDF膜、ECL购自Millipore公司；顺铂注射液购自江苏豪森公司；人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat由实验室自行保存并培养；重组质粒pCMVTRAIL由本实验室自行构建并保存。　　1.2方法　　1.2.1Jurkat细胞培养及转染人T淋巴细胞白血病细胞株Jurka

3、t由本实验室常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中，37℃，5%CO2培养箱中生长。取对数生长期细胞，离心后用无抗生素培养基稀释，以2×106细胞/ml浓度接种于6孔培养板中。取4μg质粒和10μlLipofectamine2000，分别稀释于250μl不含血清和抗生素的培养液中，轻柔混匀，室温静置5min后，将二者混匀，室温孵育20min。将混合物滴加到培养板中，轻轻晃动，使培养液混匀。转染4h后离心换液去除脂质体，继续培养24h。　　1.2.2实验分组分别设空白对照组、空质粒

4、转染组、单独DDP化疗组、单独TRAIL转染组、TRAIL联合DDP化疗组。其中，DDP化疗组及TRAIL联合DDP化疗组为转染4h换液后，加入亚细胞毒剂量浓度的DDP。　　1.2.3细胞总蛋白的提取如前述，对数生长期细胞接种于6孔培养板中，分组进行转染、加药，转染24h后，离心收集细胞。加入预冷的蛋白裂解液，14000r/min，4℃离心15min，取上清为全蛋白提取物。BCA法进行蛋白定量，分装。　　1.2.4VTRAIL重组质粒转染组和联合用药组中均有较高的TRAIL蛋白表达（图1）。　　

5、1.空白对照组，2.空质粒转染组，3.单独DDP化疗组，4.pCMVTRAIL重组质粒转染组，5.联合用药组　　图1Jurkat细胞TRAIL蛋白免疫印迹分析（略）　　　　2.2凋亡相关蛋白caspase3和NFκB表达变化VTRAIL重组质粒转染组和联合用药组又明显高于单独化疗组。与之相对应，单独DDP化疗组和pCMVTRAIL重组质粒转染组中NFκB表达显著降低，而联合用药组中未检测到NFκB表达（图2）。　　1.空白对照组，2.空质粒转染组，3.单独DDP化疗组，4.pCMV

6、TRAIL重组质粒转染组，5.联合用药组　　图2Jurkat细胞caspase3、NFκB、survivin表达（略）　　2.3survivin表达变化VTRAIL重组质粒转染组中survivin的表达无显著性差异，pCMVTRAIL重组质粒转染组稍高于空白对照组，而DDP化疗组和联合用药组中survivin表达显著降低（图2）。提示顺铂可能通过对survivin的调节，来发挥与TRAIL的协同效应。　　3讨论　　TRAIL能够选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，它的作用谱很广，能诱导结肠、肺、乳腺

7、、肾、肝、黑色素瘤、中枢神经系统肿瘤、骨肉瘤、前列腺、卵巢、宫颈等多种实体肿瘤细胞凋亡〔3～5〕，另外，还可诱导淋巴瘤、白血病及骨髓瘤、骨髓增生异常综合征〔6〕等多种血液系统恶性肿瘤细胞凋亡，近年来已成为肿瘤治疗的研究热点。然而体外实验中观察到的血液系统恶性肿瘤对TRAIL产生耐药现象，阻碍了TRAIL在临床上的进一步应用。因此，学者们开始探索TRAIL与其他抗肿瘤药物联合应用的价值，并探讨TRAIL耐药的可能机制。目前已有的研究包括TRAIL联合依托泊甙、阿糖胞苷等化疗药物治疗急性白血病〔7〕；

8、TRAIL联合亚砷酸治疗急性早幼粒细胞白血病及其他急性白血病〔8〕；TRAIL联合硼替左米或阿霉素治疗淋巴瘤细胞系〔9〕；美罗华联合rhTRAIL治疗B细胞淋巴瘤等〔10〕。在上述研究中，TRAIL均表现出与其他药物的协同效应，但其中确切的相互作用机制尚不清楚。而有关TRAIL耐药的机制，目前认为可能与死亡受体的表达及某些信号分子caspase、bcl2、XIAP等的改变有关〔11，12〕，但尚处于研究探讨阶段，无一定论。因此，探索TRAIL的耐药机制、发现新的逆转TRAIL耐药