11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病细胞对trail的敏感性研究

《11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病细胞对trail的敏感性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、11q23异常小儿急性淋巴细胞白血病细胞对TRAIL的敏感性研究【关键词】11q23;急性淋巴细胞白血病;凋亡诱导配体　40%~70%的婴幼儿急性白血病(infantacuteleukemia,IAL)存在11q23的染色体异常，包括易位、倒位、插入和缺失等，以t(4;11)(q21;q23)为最常见[1-2]。11q23异常白血病大多恶性程度高，对化疗不敏感，完全缓解率(pleteremission,CR)低，预后恶劣，且同种造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,allo-SCT)无助于改善预后[3]

2、。肿瘤的免疫监视受固有免疫和适应性细胞免疫调控，其中主要包括自然杀伤细胞(naturalkiller,NK)和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)[4-5]。研究表明，肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)相关的诱导凋亡配体(TNF-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)在CTL和NK细胞介导的抗肿瘤免疫中起重要作用[6-9]。本研究中我们探讨了11q23异常急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞对重组人可溶性TRAIL(rhsTRAIL)的敏感性，研究结果如下。　　1材料和方法　　1

3、.1研究对象　　1.1.1细胞株及临床标本11q23异常ALL细胞株3株，其中KOCL33为t(11;19)、具有FLT3-D835突变[10];KOCL69为t(4;11);KOPB26为t(9;11)。Nalm1用作TRAIL敏感性对照，11q23异常ALL细胞株3株及幼仓鼠肾(BHK)细胞株来自日本山梨大学医学部小儿科。细胞株在37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱条件下，培养于含10%FCS的RPMI-1640培养液中。取对数生长期细胞用于实验。1例患者[5月龄女孩，t(4;11)]的骨髓经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离出单个核细胞(原始细胞>95

4、%)，RPMI1640培养基离心洗涤，悬于加有10%FCS的RPMI-1640培养基中。　　1.2试剂及材料　　rhsTRAIL(KillerTRAIL)购于Alexis公司，Caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk、购于美国Sigma公司;Annexin-V-FITC购于BestBio(贝博，上海);DR4、DR5、DcR1及DcR2的单克隆抗体由顺天堂大学八木田秀雄先生惠赠。　　1.3实验方法　　1.3.13H标记的胸腺嘧啶腺苷渗入法将RPMI-1640完全培养液调制成2.0×105细胞·mL-1细胞悬液，接种于24孔板，每孔液体量为1mL(最终浓度1×105细胞·m

5、L-1)。对照孔加入新鲜培养液，TRAIL孔加入rhsTRAIL100ng·L-1作用24h，收集细胞，调制成1.0×106细胞·mL-1细胞悬液，接种于96孔平底培养板中，每孔100μL(最终浓度0.5×105细胞·mL-1)，并做三个平行样。培养板按指定方法孵育36h，并在培养的最后6h内给予3H标记的胸腺嘧啶脉冲(每孔1μCi)，然后收集到玻璃纤维滤器上。用液体闪烁计数器计算整合入DNA的放射活性。通过添加或者不添加三倍稀释(最终浓度11、33、100ng·mL-1)rhsTRAIL培养基中的42h孵育结果，确定rhsTRAIL的效果。分别加入rhsTRAIL中和性抗

6、体RIK-2(10μg·m-1)或z-VAD-fmk(20μM)LLnL(2.5μM)，阻断rhsTRAIL或caspases活性。rhsTRAIL的阻断率由以下公式算出：{1-[(处理孔的每分钟记数次数)/(未处理孔的每分钟记数次数)]}×100。　　1.3.2细胞存活率及和凋亡的检测将RPMI-1640完全培养液调制成2.0×105细胞·mL-1细胞悬液，接种于24孔板，每孔液体量为1mL(最终浓度1×105细胞·mL-1)。对照孔加入新鲜培养液，TRAIL孔加入rhsTRAIL100ng·L-1作用24h后收集细胞。a.台盼蓝拒染法确定细胞的存活率，并用以下公式计算细

7、胞存活比率：(未添加rhsTRAIL培养基中的细胞存活比率)-(添加rhsTRAIL培养基中的细胞存活比率)。b.用FITC标记的Annexin-V染色，流式细胞仪(BD,FACSCalibur)检测早期凋亡。　　1.3.2TRAIL受体在细胞表面的表达细胞株、临床标本以及幼仓鼠肾(BHK)细胞株(1×106个细胞)与1μg生物素标记的鼠IgG1或者单抗在冰上孵育30min，随后与藻红蛋白标记的抗生物素蛋白链菌素(上海亚培生物科技)冰上孵育30min，用流式细胞仪检测。相对荧光强度(RFI)为特异染色的平均荧光强度