cmv抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用论文

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1、CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用论文宋鹏，刘陶，杨浩，韩锋产，陈五岭【关键词】人巨细胞病毒Developmentandprimaryapplicationofimmunogoldfastdetectionkitforhumancytomegalovirus【Abstract】AIM:Todevelopacheapandeasytousekitbasedondotimmunogoldfiltrationassayforanalysisofantibodyofthehumancytomlegalovirusinse

2、rum.METHODS:VIgG,thereultipleantigenicpeptideofhumancytomlegalovirusmobilized.RESULTS:Atotalof120serapleandrapidassayfordetectingantiHCMVIgGinsera.【Keyancytomegalovirus;Branchedmultipleantigenicpeptide;gololcolloid;enzymelinkedimmunosorbentassay【摘要】目的：开发一种低成本、简单易用的

3、基于免疫金渗滤法的试剂盒，以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体.方法：将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上，制成免疫层析检测试纸条，血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动.freelRNA以及病毒培养等，但由于以上方法耗时耗力［2］，且检测费用较高，不适合在基层临床医疗机构的普及性筛查.为此，我们采用人工合成的包含HCMV抗原表位的线形多肽以及多抗原肽，采取胶体金免疫层析法［3］，对HCMV进行快速检测.1材料和方法1.1材料制备型HPLC（Beck

4、man公司）；核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；激光解析质谱（Heoc）保护的氨基酸（Merck公司）；1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼（TBTU）、1羟基苯并三氮唑（HOBT）（ABI公司）；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA）（Sigma公司）；G10,G25凝胶（Pharmacia公司）；乙腈（Fisher公司）；HCMVELISA对照试剂盒（德国VIRION公司）；氯金酸（成都化学试剂厂）；葡萄球菌A蛋白(SPA)（卫生部上海生物制品所）；点膜器（美国BioDot公司）.HCMV质控血清为第四军医大

5、学全军基因诊断技术研究所提供，血清标本从第四军医大学西京医院收集.1.2方法1.2.1HCMV抗原表位设计参照文献［4］，根据KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果设计合成了HCMVgp55抗原表位序列如下：VTSGSTKD（aa798to805）.1.2.2线性肽的合成将PACPEGPS树脂0.5g（替代度0.2mmol/g）用二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30min，进行活化.采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接.称取待连接的氨基酸195mg，加入1.5mL二氯甲烷DCM和3滴DMF使之溶解，

6、加入1mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275mL，磁力搅拌，室温下反应15min，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐.将对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1min，然后加入0.1mol/L4二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF460μL，摇动反应90min，吹去反应液，用10mLDMF洗涤3次，吹干.其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300g/L哌啶/DMF溶液50mL反应15min，以脱去芴甲氧羰基（FM

7、OC）保护基团.取2.0mmol的保护氨基酸，用1mol/LDIEA/DMF5mL溶解，加入4.0mmol的TBTU和4.0mmol的HOBT（DMF为溶剂），预反应15～20min，然后和氨基酸树脂一起反应2h，吹去反应液，50mLDMF冲洗3次，吹干.将已合成好全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中.按照TFA∶水＝95∶5（V/V）的比例配制切割试剂，使用时按25mL切割试剂与1g树脂反应的比例进行切割，反应时间为2h.将反应液快速倒入150mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却.将沉淀重新加蒸馏水溶解，再

8、转移到冻干机中冻干.1.2.3八分支多抗原肽的合成将赖氨酸作为第一个氨基酸按1.2.2的方法进行连接.每次均脱保护15min以上，偶联60min.连接3次，得到八分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，按照1.2.2方法依次进行八肽的连接.1.2.4免疫胶体金的