cmv抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用

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1、CMV抗体免疫金快速检测试剂盒的开发与初步应用宋鹏，刘陶，杨浩，韩锋产，陈五岭【关键词】人巨细胞病毒Developmentandprimaryapplicationofimmunogoldfastdetectionkitforhumancytomegalovirus　　【Abstract】AIM:Todevelopacheapandeasytousekitbasedondotimmunogoldfiltrationassayforanalysisofantibodyofthehumancytomlegaloviru

2、sinserum.METHODS:VIgG,thereultipleantigenicpeptideofhumancytomlegalovirusmobilized.RESULTS:Atotalof120serapleandrapidassayfordetectingantiHCMVIgGinsera.　　【Keyancytomegalovirus;Branchedmultipleantigenicpeptide;gololcolloid;enzymelinkedimmunosorbentassay　　【摘要】目的

3、：开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的试剂盒，以用于检测分析血清中的巨细胞病毒抗体.方法：将用人工合成的人巨细胞病毒(HCMV)抗原表位的线性肽和分支多抗原肽分别划线固定于硝酸素纤维膜上，制成免疫层析检测试纸条，血清中IgG与测试条上金标记物结合后沿硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗原结合形成肉眼可见的红色带条并用GICA和ELISA试剂盒对比检测120份血清标本中抗HCMV抗体.结果：分支多抗原肽制成的免疫层析检测试纸条的灵敏度为97.9%，特异度为87.5%，两法符合率为95.8%.结论：GICA检测血清

4、中的抗HCMV抗体特异性强，灵敏度高，简便快速，有广泛应用价值.　　【关键词】人巨细胞病毒；分支多抗原肽；胶体金；酶联免疫吸附测定　　0引言　　人巨细胞病毒（HCMV）感染的普遍性和严重性已引起医学界的高度重视〔1〕.但HCMV感染时，临床症状变化很大，可随患者年龄、机体状况、感染途径不同而异.现今实验室检测手段包括ELISA检测患者血清中IgG和IgM，套式PCR技术检测血清HCMV的DNA，RTPCR检测HCMV的mRNA以及病毒培养等，但由于以上方法耗时耗力〔2〕，且检测费用较高，不适合在基层临床医疗机构的普

5、及性筛查.为此，我们采用人工合成的包含HCMV抗原表位的线形多肽以及多抗原肽，采取胶体金免疫层析法〔3〕，对HCMV进行快速检测.　　1材料和方法　　1.1材料　　制备型HPLC（Beckman公司）；核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；激光解析质谱（Heoc）保护的氨基酸（Merck公司）；1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼（TBTU）、1羟基苯并三氮唑（HOBT）（ABI公司）；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA）（Sigma公司）；G10,G25凝胶（Pharmacia公司）；乙腈（Fisher

6、公司）；HCMVELISA对照试剂盒（德国VIRION公司）；氯金酸（成都化学试剂厂）；葡萄球菌A蛋白(SPA)（卫生部上海生物制品所）；点膜器（美国BioDot公司）.HCMV质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供，血清标本从第四军医大学西京医院收集.　　1.2方法　　1.2.1HCMV抗原表位设计参照文献〔4〕，根据KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果设计合成了HCMVgp55抗原表位序列如下：VTSGSTKD（aa798to805）.　　1.2.2线性肽的合成将PACPEGPS树脂

7、0.5g（替代度0.2mmol/g）用二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30min，进行活化.采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接.称取待连接的氨基酸195mg，加入1.5mL二氯甲烷DCM和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275mL，磁力搅拌，室温下反应15min，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐.将对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1min，然后加入0.1mol/L4二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF

8、460μL，摇动反应90min，吹去反应液，用10mLDMF洗涤3次，吹干.其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300g/L哌啶/DMF溶液50mL反应15min，以脱去芴甲氧羰基（FMOC）保护基团.取2.0mmol的保护氨基酸，用1mol/LDIEA/DMF5mL溶解，加入4.0mmol的TBTU和4.0mmo